[发明专利]一种分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，所述真菌为米曲霉。 

背景技术

米曲霉可以产复合酶，如：蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等，不产毒素，是食品工业中安全的工业菌株。这些复合酶分解后的原料易被人体吸收，营养价值大大提高，多种发酵食品中都用米曲霉来分解原料。 

蛋白质组学研究是基于基因组测序技术和质谱鉴定技术而出现的一种研究方法，它的研究包括了一个细胞或一个微生物的全套蛋白质，也是后基因组计划中一个很重要的内容。研究蛋白质组学最经典的方法是先通过双向凝胶电泳分离蛋白再运用质谱鉴定确定蛋白序列。米曲霉蛋白质组学的研究相对较少，早些时候有研究者就通过二维电泳凝胶分离技术对米曲霉细胞内部蛋白进行了分离，但是后期鉴定蛋白功能的工作没有进行下去。直到2006年，日本的研究工作者利用蛋白质组学的方法探讨了米曲霉在固体和液体培养条件下胞外蛋白酶的分泌情况，通过质谱鉴定总共确定了29个蛋白，开辟了运用蛋白质组学研究蛋白分泌的先河。目前，还没有采用蛋白质组学的方法分析米曲霉发酵过程中蛋白表达的报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，本发明为了探寻功能基因指导的蛋白表达分泌情况，通过绘制蛋白质组学图谱，分析其发酵过程中蛋白表达，寻找对其发酵起重要作用的蛋白及其调控基因，本发明以米曲霉为例 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 

一种分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，步骤如下：  

⑴等电聚焦：收集发酵过程中菌丝体，PBS缓冲液洗涤3次，加入液氮研磨至粉末状，加入适量裂解液和50μg/ml DNase I、50 μg/ml RNase，混匀，冰浴15分钟，冰浴超声2分钟，14000 rpm，4度离心30分钟取上清，从冰箱中取出美国Bio-Rad公司的pH 4-7的IPG预制胶条，用溶胀缓冲液将胶条泡胀12小时；将胶条取出放入聚焦槽内，加入矿物油至没过上样杯，并用上样缓冲液稀释至170μl，对好正、负极，盖上盖子，MultiphorII电泳系统进行等电聚焦； 

⑵平衡：聚焦结束的胶条先将胶条放入平衡缓冲液I水平振荡15分钟，再将胶条转入平衡缓冲液II水平振荡15分钟； 

⑶第二向SDS-PAGE电泳：第二次平衡结束后，将胶条从样品盘中移出，放到已配好的12%的SDS-PAGE凝胶上端，并将marker放到凝胶的一端，再用0.5%的琼脂糖将胶条和marker封严，不能产生气泡，并将胶板固定于电泳槽内，加入电泳缓冲液，接通电源，15mA/胶恒流电泳15分钟，然后250v恒压电泳，待溴酚蓝达到底部边缘时即可停止电泳，电泳结束后，撬开两层玻璃，取出凝胶，将凝胶放入装有染色液的水平盘内振荡过夜进行染色，染色后，将凝胶浸于脱色液中，水平摇床振荡脱色； 

⑷蛋白点的胶内酶解：①凝胶平铺于染色盘上，切下用于质谱检测的蛋白点，用50 μL去离子水将其吹入96孔PCR板的小孔中，吸出去离子水后加入50 μL脱色液； 

②在50℃条件下振荡15 分钟，将脱色液吸出，重复一次，直至胶块完全呈无色状； 

③加50 μL去离子水，50℃振荡15 分钟，洗去残留的脱色液和胶块中的离子； 

④加30 μL乙腈，静置5-10 分钟，胶块变为白色后吸出乙腈，室温静置20 分钟，使乙腈挥发；  

⑤在胶块上面加6-12 μL的酶解液，使酶解液没过胶块，封好PCR板，37℃振荡过夜酶解；  

⑸MALDI-TOF 4700 Proteome Analyser质谱仪鉴定蛋白 

①把质谱样品板洗干净抛光，然后用异丙醇去极性后晾干，备用； 

②在质谱样品板四周边缘六个孔上都点上ABI公司校准液，在中间点样孔处点上0.3 μL酶解液后再点上0.3 μL质谱自带基质溶液自然混合，晾干； 

③冷风吹去样品板上的灰尘杂质，放入质谱仪测定； 

④美国ABI公司的GPS 3.5软件对质谱数据进行分析，米曲霉蛋白质数据库检索。 

而且，所述裂解液成分为：8M尿素，2M硫脲，0.5% g/%ml，CHAPS，2% g/%ml美国Bio-Rad公司pH4-7两性电解质，1wt%DTT，1mM PMSF。