[发明专利]一种靶向微泡造影剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种靶向微泡造影剂及其制备方法。 

背景技术

微泡造影剂作为基因治疗中的一种安全载体，在超声辐照下能够有效地进行靶向性基因转染，成为当前肿瘤基因治疗领域的研究热点。将载有目的基因的微泡造影剂经静脉注射后，在靶组织给予一定条件的超声照射，可使血管内的微泡破裂并释放基因，同时产生“空化效应”和“声孔效应”可使毛细血管穿透性及细胞膜通透性增加，从而促进释放基因大量进入靶细胞，具有安全、无创，并可作用于深部组织和器官的特点，是一种新型的基因靶向传输技术，具有广阔的发展空间。 

然而普通微泡载基因微泡造影剂本身并无主动靶向性，与组织没有特异性结合位点，经血管注射后，微泡在体内将随机分布，只有超声辐照处的微泡才能定向破裂释放基因，大量的微泡流经超声辐照以外的部位，自由分解消化，从而造成微泡及基因的大量流失破坏。因此在微泡上连接肿瘤特异性靶向配体或抗体，导致更多的“配体-受体对”形式，使微泡和靶器官之间结合的更紧密。尽管如此，在体内环境下，由于血液具有流动性，靶向微泡与受体接触时间短暂，靶向微泡配体-受体对形成数量不足，而且血流冲刷作用又会将一部分结合的靶向微泡冲刷掉，导致有效的靶向微泡配体-受体数量有限，基因转染率仍达不到理想水平。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够有效增加靶向微泡配体-受体对形成数量，进一步提高载基因微泡基因转染率的靶向微泡造影剂及其制备方法。 

本发明提供的靶向超声微泡造影剂，为平均粒径为1-4微米的微泡混悬液，球壁材料包括DSPE和DPPA和聚乙二醇和泊洛沙姆，包裹气体为氟碳类组织相容性惰性气体，溶液为去离子双蒸馏水，球壁材料中还含有结合多肽配体c(RGDyK)的PEG连接臂，其结构为DSPE-PEG-c(RGDyK)。 

所述DSPE的重量百分含量为造影剂的0.2%-0.8%，DPPA的重量百分含量为造影剂的0.02%-0.2%。 

所述球壁材料中聚乙二醇分子量为4000-6000，其重量百分含量为造影剂的0.05%-0.4%。 

所述泊洛沙姆的重量百分含量为造影剂的0.01%-0.1%。 

所述氟碳类组织相容性惰性气体为全氟丙烷。 

所述PEG连接臂中PEG分子量为800-2000，DSPE-PEG-c(RGDyK)的重量百分含量为造影剂的0.1%-0.2%。 

上述的靶向超声微泡造影剂的制备方法，包括以下步骤： 

（1）将c(RGDyK)和DSPE-PEG和DIEA（N’N-二异丙基乙胺）加入到乙腈中，加入HBTU,室温下反应得到DSPE-PEG-c(RGDyK)； 

（2）将DSPE、DPPA和泊洛沙姆，40-60℃充分混悬于双蒸水中，制成混悬液A，将DSPE-PEG-c(RGDyK)溶于无水乙醇中，溶解完全，制成溶液B； 

（3）混悬液A于探头超声仪中进行超声处理，在超声过程中逐滴加入溶液B，得到澄清液C； 

（4）将聚乙二醇加入澄清液C中，溶解完全；再将氟碳类组织相容性惰性气体通入溶液C中，充分饱和的同时，应用高速机械剪切设备处理，形成平均 粒径为1-4微米的微泡混悬液。 

本发明的微泡造影剂采用的靶向配体为环状五肽c(RGDyK)，即cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys)，其分子片段小，且易进行共价偶联。该配体既可与微泡采用共价方法稳定连接，又可与整合素靶向性结合；而整合素由于仅在肿瘤毛细血管及肿瘤细胞有高表达，而在正常细胞不表达或表达甚微，所以c(RGDyK)是较理想的配体，具有肿瘤新生血管靶向和肿瘤细胞特异性靶向功能。 

PEG为亲水性高聚合度的柔性连接臂。运用其作为连接臂的靶向微泡水溶性好，在体内具有较长的半衰期。可使微泡在体内有较长的时间与靶器官更加紧密的结合。 

二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE），具有性质稳定，抗氧化性强，成品稳定等特点，是首选的辅料。 

本发明的靶向微泡造影剂，以肿瘤组织中的整合素为靶点，采用共价偶联法，通过PEG衍生物连接臂（PEG-DSPE）将c(RGDyK)以共价结合法连于自制脂质微泡上制备出带连接臂的靶向微泡造影剂，使PEG连接臂一端连着含有RGD结构的与之结合力强的环状五肽c(RGDyK)配体，另一端与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）相连。