[发明专利]一种鉴定发酵酸面团中真菌菌相组成的方法

权利要求书

1.一种鉴定发酵酸面团中真菌菌相组成的方法，包括：

（1）将发酵酸面团用淀粉酶酶解，得到酶解物；

（2）从酶解物中提取真菌总基因组DNA；

（3）以提取的真菌总基因组DNA为模板，利用带有GC夹子的真菌通用引物ITS5.8S与28S-1-GC进行第一轮PCR扩增；

（4）以第一轮PCR扩增后得到的阳性产物为模板，利用真菌通用引物ITS5.8S与28S-1进行第二轮PCR扩增；

（5）对第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增的产物进行分析，确定发酵酸面团中真菌菌相组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的淀粉酶为α-淀粉酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的发酵酸面团与淀粉酶的重量比为0.5:1-1:1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的酶解温度为60-65℃，时间为20-30min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，提取真菌总基因组DNA后，将DNA的浓度调整为45-55ng/uL，再进行第一轮PCR扩增。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的第一轮PCR为降落PCR。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，降落PCR的反应条件：95℃预变性5min，然后在95℃变性30s，60℃引物复性1min，72℃引物延伸2min，循环20次，每循环一次，复性温度降低0.5℃；之后，95℃变性30s，50℃复性30s，72℃延伸2min，循环5次后72℃终延伸10min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，第二轮PCR的反应条件为：95℃预变性5min，然后在95℃变性30s，50℃引物复性30s，72℃引物延伸2min，循环4次，72℃终延伸10min。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述的分析包括如下步骤：合并第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增的产物并纯化，然后进行变性梯度凝胶电泳分离，将得到的扩增条带进行染色、纯化、克隆测序，之后与标准菌序列比对，判定真菌种类。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的变性梯度凝胶电泳的变性梯度为35%-65%，电泳电压为48-52V，电泳时间为12-13h。