[发明专利]一种鉴定发酵酸面团中真菌菌相组成的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物菌群构成鉴定领域，尤其涉及一种鉴定发酵酸面团中真菌菌相组成的方法。

背景技术

传统发酵酸面团，即馒头发酵剂，也称为老面、老酵头或面肥，是指上次做馒头留下来的发酵面团，以此作为主要发酵菌种，加入面粉和成面团，过夜发酵，次日在面团中添加面粉和适量碱，和面后成型，醒发蒸制馒头。

传统发酵酸面团是多种微生物共生的微生态体系，是多种微生物糖化、发酵、酯化的协同作用，组织结构更趋于柔软细腻而富有弹性的口感，而且生成了醇、酯、醛、酚、酸、低分子糖、多肽、氨基酸等多种风味物质。国外面包的酸面团与我国传统发酵剂相似，但国外对于酸面团已经研究了很多年了，而我国传统发酵剂的研究，特别是微生物的研究却非常薄弱。国外对酸面团微生物的研究表明，其菌种组成与地理位置也有着很大的联系，一般是真菌，主要为酿酒酵母，起着发酵面团的作用，有些地方的酵子制作时要接种一定量的酒曲，酒曲中除了作为糖化发酵剂的霉菌外，还有丰富的酶系，酒曲具有糖化、发酵和酯化的能力，可以辅助酵母的发酵。根霉菌是霉菌中一种具有多酶系特征的霉菌，根霉能产生丰富的淀粉酶，使淀粉变为糖分，具有很好的糖化性能。它除了能分泌淀粉酶外，还能分泌酸性蛋白酶、酒化酶及乳酸、琥珀酸等多种有机酸和乙醇等，可以在整个发酵过程中始终边糖化、边发酵连锁进行。有研究表明，在活性干酵母发酵馒头过程中，选择添加安琪甜酒曲来研究根霉菌对馒头感官品质的影响，发现使用酵母菌与根霉菌混合发酵的馒头评分最高，而酵母菌和乳酸菌混合发酵的馒头评分最低，可以看出我国传统酵子中根霉菌对馒头的品质具有一定的影响，这与西方酸面团的菌种有很大的差别。

变性梯度凝胶电泳DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)技术是由Fischer和Lerman在1979年提出并用于检测DNA突变的电泳技术，是利用片段之间GC含量不同，在不同变性浓度梯度下解链程度不同而将不同片段分离开来。DGGE分辨度高于琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，理论上可以检测到单个核苷酸水平的差异，已被广泛的应用于分析环境微生物菌群结构、肠道及口腔中微生物菌群多样性的分析。

目前，采用DGGE技术分析我国不同地区发酵酸面团中真菌菌相组成的报道并不是很多。国外面包的发酵剂即酸面团与我国馒头的老面有相似的制作原理和发酵工艺，但国外研究者已对酸面团中具有代表性的菌种及其特性研究的比较透彻，有些已应用于工业化生产，而我国有丰富的发酵剂资源，但对其认识尚处于初级阶段。因此，迫切需要揭示我国传统发酵酸面团中微生物的菌群结构及其种类，合理开发我国传统发酵食品中微生物资源。

发明内容

本发明提供了一种鉴定发酵酸面团中真菌菌相组成的方法，用于分析发酵酸面团中真菌菌相组成和种类，具有快速简便、特异性好、灵敏度高、准确可靠的特点。

一种鉴定发酵酸面团中真菌菌相组成的方法，包括：

（1）将发酵酸面团用淀粉酶酶解，得到酶解物；

（2）从酶解物中提取真菌总基因组DNA；

（3）以提取的真菌总基因组DNA为模板，利用带有GC夹子的真菌通用引物ITS5.8S与28S-1-GC进行第一轮PCR扩增；

（4）以第一轮PCR扩增后得到的阳性产物为模板，利用真菌通用引物ITS5.8S与28S-1进行第二轮PCR扩增；

（5）对第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增的产物进行分析，确定发酵酸面团中真菌菌相组成。

发酵酸面团可以为传统发酵酸面团，即上次做馒头留下来的发酵面团。传统发酵酸面团中真菌种类多，先对其进行酶解后再进行PCR反应，可有效鉴定出真菌菌相组成。

步骤（1）中，所述的酶解可以为：将发酵酸面团加入淀粉酶溶液中，混匀，进行酶解反应。

所述的淀粉酶可以为α-淀粉酶。发酵酸面团中淀粉含量较高，在样品热处理时，淀粉易发生溶胀，包裹住发酵酸面团中的微生物，从而影响微生物总基因组DNA的提取，α-淀粉酶能有效酶解发酵酸面团中淀粉α-1,4糖苷键，生成小分子糊精和其他低聚糖，增加面团的流动性，使酸面团中微生物充分释放于溶液中，以便有效提取全部微生物的总DNA。采用α-淀粉酶的特征是其能引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以葡萄糖为主，此外，还有少量麦芽三糖及麦芽糖。

为了获得更好的酶解效果，所述的发酵酸面团与淀粉酶的重量比优选为0.5:1-1:1；更优选为1:1。