[发明专利]苏云金芽胞杆菌高效表达载体、构建方法及应用

权利要求书

1.一种表达载体，其结构特征为：将cry8E基因启动子与大肠杆菌表达载体pET-21b的非启动子表达区的重叠片段插入经酶切后的骨架载体pHT315的多克隆位点之间。

2.根据权利要求1所述表达载体为pHT315-8E21b，其序列如SEQ ID NO18所示。

3.权利要求1或2所述表达载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)获得cry8E基因启动子和pET-21b的非启动子表达区的重叠片段8E-21b，

(2)插入经酶切后的骨架载体pHT315的多克隆位点之间。

4.权利要求3所述的构建方法，所述步骤（1）的方法为：以Bt185菌株基因组DNA为模板，用引物对8E-up/8E-down（SEQ ID NO11/12）扩增cry8E基因的启动子序列，大小为1352bp；以大肠杆菌表达载体pET-21b质粒为模板，用引物对21b-up/21b-down（SEQ ID NO13/14）扩增得到无启动子的pET-21b表达区片段，大小为213bp，其中包括多克隆位点；回收两个PCR产物，以此为模板，用引物8E-up和21b-down进行重叠PCR，获得cry8E基因启动子和pET-21b表达区的重叠片段8E-21b，大小为1565bp，所述骨架载体的pHT315经EcoRI/HindIII双酶切，

所述8E-up序列如SEQ ID NO11所示，所述8E-down序列如SEQ ID NO12所示，

所述21b-up序列如SEQ ID NO13所示，所述21b-down序列如SEQ ID NO14所示。

5.一种重组表达载体，在权利要求1或2所述表达载体的多克隆位点之间插入目的基因。

6.根据权利要求5所述重组表达载体为pHT-8E-1Ac，其序列如SEQ ID NO19所示。

7.菌株HD-8E1Ac，其特征是含有权利要求6所述的重组表达载体pHT-8E-1Ac。

8.权利要求5或6所述表达载体在表达Cry蛋白中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，所述蛋白为Cry1Ac。