[发明专利]苏云金芽胞杆菌高效表达载体、构建方法及应用

说明书

该申请为申请号为2012101193981，发明名称为“苏云金芽胞杆菌高效表达载体、构建方法及应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及苏云金芽胞杆菌高效表达载体的构建方法及应用。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种广泛存在于土壤中的细菌，其可以在生长稳定期形成芽胞，且芽胞内含有晶体，晶体主要组成成份是杀虫晶体蛋白（亦称为δ-内毒素）由cry和cyt基因编码，具有特异的杀虫活性[Sanahuja,G.,R.Banakar,R.M.Twyman,et al.,2011.Bacillus thuringiensis:a century of research,development and commercial applications.Plant Biotechnol J.9(3):p.283-300]。多种Bt产品被应用于农业害虫和卫生害虫蚊子的防治[Bravo,A.,S.Likitvivatanavong,S.S.Gill,et al.,2011.Bacillus thuringiensis:A story of a successful bioinsecticide.Insect Biochem Mol Biol.41(7):p.423-31]。根据cry基因表达调控的特点可以将其分为两类，芽胞依赖型cry基因如cry1A、cry2A、cry4A、cry4B和cry11A等，和不依赖芽胞形成的cry基因，如cry3A[Ibrahim,M.A.,N.Griko,M.Junker,et al.,2010.Bacillus thuringiensis:a genomics and proteomics perspective.Bioeng Bugs.1(1):p.31-50.Bravo,A.,H.Agaisse,S.Salamitou,et al.,1996.Analysis of cryIAa expression in sigE and sigK mutants of Bacillus thuringiensis.Mol Gen Genet.250(6):p.734-41.Agaisse,H.and D.Lereclus,1994.Expression in Bacillus subtilis of the Bacillus thuringiensis cryIIIA toxin gene is not dependent on a sporulation-specific sigma factor and is increased in a spo0A mutant.J Bacteriol.176(15):p.4734-41.]。而不同机制的启动子需要不同的转录因子，如cry1Ac启动子为重叠的双启动子BtⅠ和BtⅡ，二者分别由σ^E和σ^K调控[Sedlak,M.,T.Walter,and A.Aronson,2000.Regulation by overlapping promoters of the rate of synthesis and deposition into crystalline inclusions of Bacillus thuringiensis delta-endotoxins.J Bacteriol.182(3):p.734-41]；cry4A为非重叠双启动子p1和p2，在过渡期受到σ^H的调控有较弱表达[Yoshisue,H.,T.Fukada,K.Yoshida,et al.,1993.Transcriptional regulation of Bacillus thuringiensis subsp.israelensis mosquito larvicidal crystal protein gene cryIVA.J Bacteriol.175(9):p.2750-3]；cry8E基因与其上游orf1基因以操纵子形式进行转录，操纵子中的两个启动子受到σ^H和σ^E调控（未发表资料）；cry3A从营养期即开始表达，受到σ^A的调控[Agaisse,H.and D.Lereclus,1994.Expression in Bacillus subtilis of the Bacillus thuringiensis cryIIIA toxin gene is not dependent on a sporulation-specific sigma factor and is increased in a spo0A mutant.J Bacteriol.176(15):p.4734-41]，而sigK基因功能的丧失有利于cry3A启动子在产胞后期的转录。