[发明专利]一种以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法

说明书

 

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法。

背景技术

黑豆与黄豆均属于大豆，但黑豆在营养数量和质量上都具有优势。黑豆富含异黄酮和黄酮混合物、大量的食物纤维素、不饱和脂肪酸、丰富的蛋白质、多种矿物质和微量元素，特别是黑色种皮含有多种色素和皂甙以及独特的活性物质。另外黑豆中含有大量能降低恶性胆固醇的大豆球蛋白、亚油酸以及降低中性脂肪的亚麻酸等，这些有用成分具有软化血管、扩张血管、促进血液流通的作用，并且具有降血脂、预防心血管疾病、抗氧化、延缓衰老、增加胃肠蠕动等功效。黑豆在医药工业中是廉价的重要原料，自古就有“大豆数种，唯黑入药”的记载。从黑豆中提取的卵磷脂、大豆异黄酮、皂甙等活性物质可预防和治疗心血管疾病、高血压及癌症。

心脑血管疾病严重威胁着人类的身体健康，是现今仅次于癌症的第二大病症，全世界共有血栓病人1500万，所需的溶栓剂的潜在市场约20亿美元。目前常用的及一些还在开发的治疗心脑血管栓塞疾病的药品均在不同程度上存在一定的缺陷，或者毒性比较强、副作用大，或在体内半衰期较短、药效难以发挥，或来源紧缺、价格昂贵等，很难成为一种大众药品，而纳豆激酶却有望弥补这些缺陷。

由于纳豆激酶具有目前市场上正在使用的溶栓药物所不具有的优点，那么提高纳豆激酶的单位产物的酶活力和生产效率对纳豆激酶的推广应用具有重要的意义。目前纳豆激酶的生产方式主要是以发酵为主。在发酵方式上有固体发酵和液体发酵，固体发酵具有原料普遍易得、成本低、设备简单、产酶活力高等优点。目前用固体发酵方法生产纳豆激酶多是用黄豆为原料进行发酵，存在酶活不高及氨臭味大等缺点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法，包括如下步骤：用特制营养液浸泡黑豆，将浸泡后的黑豆进行蒸煮，再接种纳豆菌进行发酵。

所述的特制营养液包括如下浓度成分：乳糖5-15g/L、胰蛋白胨10-30g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 1-10g/L、NaH₂PO₄·2H₂O 0.5-1.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1-1g/L、CaCl₂ 0.1-0.5g/L，pH 7.0-7.5。

优选的，所述的特制营养液包括如下浓度成分：乳糖10g/L、胰蛋白胨20g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 5g/L、NaH₂PO₄·2H₂O 1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、CaCl₂ 0.2g/L，pH 7.2。

所述的黑豆与特制营养液的质量体积比（g/mL）优选为1 : 3。

所述的浸泡优选为15-25℃浸泡16-20h。

所述的蒸煮优选为0.1MPa 、121℃蒸煮30-40min。

所述的接种优选为将蒸煮后的黑豆自然冷却至40-50℃后于无菌条件下按原料（黑豆）重量的10%接种纳豆菌种子液；所述的种子液是由斜面菌株经摇瓶培养制备；种子培养液及培养条件：以LB培养基为种子培养基，pH为7.2，三角瓶装液量为25mL/250mL，培养温度37℃，摇床转速为180r/min，培养周期为16h。

所述的纳豆菌为Bacillus subtilis QK02，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO: M 203078。

所述的发酵的条件优选为温度37-42℃，湿度75%-85%，物料厚度2-3cm，发酵时间为24h。

上述以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法，还包括提取分离和冷冻干燥步骤。

所述的提取分离包括浸提、沉淀、柱层析步骤，具体如下：

（1）浸提：按质量体积比（g/mL）1 : 1 的比例往发酵后的产物加入生理盐水于4℃浸提12-24h，再于4℃、8000 r/min离心15min，所得上清为发酵粗酶液；