[发明专利]一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌及其构建方法和蛋白表达

权利要求书

1.一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌，其特征在于：

所述的重组菌于2013年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7331。

2.根据权利要求1所述的一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌，其特征在于：

所述重组菌是以保藏编号为CGMCC No.0743的大肠杆菌BL21为出发菌，敲除ptsG基因得到的大肠杆菌工程菌。

3.一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌的构建方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

以保藏编号为CGMCC No.0743的大肠杆菌BL21为出发菌，采用Red同源重组，用安普霉素抗性基因替换大肠杆菌基因组上的ptsG基因，然后通过质粒pCP20表达的FLP内切酶消除安普霉素抗性基因，得到敲除ptsG基因的大肠杆菌工程菌。

4.一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌的蛋白表达，其特征在于：

由以下步骤实现：

1）将重组菌在LB固体平板上划线，34℃培养12h，转接于另一LB固体平板，34℃继续培养12h，得到活化的种子平板；

2）从种子平板上挑取单菌落，接种于含50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，34℃培养12h，转接于含50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，34℃培养6h，最后以1%-8%接种量接种于终容量为50ml培养基的250ml三角瓶中，34℃，220rpm培养，发酵生产类人胶原蛋白，在发酵到6h时，将温度提高到42℃诱导类人胶原蛋白表达，诱导3h，发酵到9h时将温度调为39℃，使菌体继续生长并继续表达类人胶原蛋白，发酵到12h-14h时发酵结束。

5.根据权利要求4所述的一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌的蛋白表达，其特征在于：

步骤2）中，所述培养基为专用发酵培养基，其配方为：葡萄糖 10-15g/L，酵母粉 10-12g/L，硫酸铵 5-6g/L，磷酸氢二钾8-9g/L，磷酸二氢钠4-5g/L，EDTA 1.0-1.5g/L，微量元素0.5-1.5ml，硫酸镁 1-2g/L，卡那霉素 0.0025-0.0035g/L，余量为水。

6.根据权利要求4所述的一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌的蛋白表达，其特征在于：

步骤2）中，所述培养基为M9培养基。

7.一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌的蛋白表达，其特征在于：

由以下步骤实现：

1）将重组菌在LB固体平板上划线，34℃培养12h，转接于另一LB固体平板，34℃继续培养12h，得到活化的种子平板；

2）从种子平板上挑取单菌落，接种于2瓶含80ml LB液体培养基的300ml三角瓶中，34℃培养12h，转接于8瓶含80ml LB液体培养基的300ml三角瓶中，34℃培养10h，最后将640ml种子液接种于含16L灭过菌的发酵培养基的30L发酵罐中，溶解氧通过通入纯净的空气控制在25%饱和度，pH通过加入氨水控制在6.8，当底物培养基消耗光了之后开始通过补料方式补加新鲜的培养基，当OD₆₀₀达到大约45 g DCW/L时，升温至42℃诱导类人胶原蛋白表达，维持3h，调节温度至39℃，使菌体继续生长并继续表达类人胶原蛋白。

8.根据权利要求7所述的一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌的蛋白表达，其特征在于：

步骤2）中，所述培养基为专用发酵培养基，其配方为：葡萄糖 10-15g/L，酵母粉 10-12g/L，硫酸铵 5-6g/L，磷酸氢二钾8-9g/L，磷酸二氢钠4-5g/L，EDTA 1.0-1.5g/L，微量元素0.5-1.5ml，硫酸镁 1-2g/L，卡那霉素 0.0025-0.0035g/L，余量为水。