[发明专利]一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌及其构建方法和蛋白表达

说明书

技术领域

    本发明涉及一株重组菌，具体涉及一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌及其构建方法和蛋白表达。

背景技术

胶原蛋白具有生物吸收性、细胞粘附性、促新细胞形成、促上皮细胞形成及生物兼容性等特性，使它具有非常广泛的潜在用途，一直是生物医学材料领域关注的热点，而人源型水溶性胶原蛋白的研发生产一直是世界科学家研究的热点。类人胶原蛋白是将人体已知序列胶原蛋白的一段mRNA逆转录生成cDNA后，经过特定序列重复和修饰，转化于大肠杆菌中，并经过高密度发酵、分离提取及纯化而得。它解决了动物提取胶原蛋白的水不溶性和病毒隐患（疯牛病、猪瘟疫、禽流感）等问题，并且具有良好的生物学特性和功能，相比动物体提取胶原蛋白优良，免疫排异反应低。

目前，在利用大肠杆菌发酵生产类人胶原蛋白的过程中，乙酸等代谢副产物的积累始终是影响菌体生长及重组蛋白表达的最不利因素，传统的减少乙酸等代谢副产物的方法一般为：采用分批补料培养方式、两阶段培养方式及在位移除代谢副产物等方法。在分批-补料培养方式中，是通过控制营养物的添加速率及细胞生长速率来减少乙酸的积累，但是这就导致类人胶原蛋白的产量偏低，另外，复杂的补料策略也需要持续的对发酵过程进行监督，这就导致发酵过程十分的不方便，而且易受到人为操作失误的影响；另一种减少乙酸积累的方法是通过分离设备，如中空纤维，将部分培养基流出，并且加入新鲜的培养基以保持恒定的反应体积。但是这种方法并没有显著提高单位体积类人胶原蛋白的产量。这些方法都只是用工程学的手段来减少乙酸积累以达到提高类人胶原蛋白的产量，但是效果往往比较差，不能满足高产的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌及其构建方法和蛋白表达，能有效减少乙酸分泌，避免乙酸积累对菌体生长和重组蛋白表达的影响。

本发明所采用的技术方案是：

一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌，其特征在于：

所述的重组菌于2013年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7331。

所述重组菌是以保藏编号为CGMCC No.0743的大肠杆菌BL21为出发菌，敲除ptsG基因得到的大肠杆菌工程菌。

一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌的构建方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

以保藏编号为CGMCC No.0743的大肠杆菌BL21为出发菌，采用Red同源重组，用安普霉素抗性基因替换大肠杆菌基因组上的ptsG基因，然后通过质粒pCP20表达的FLP内切酶消除安普霉素抗性基因，得到敲除ptsG基因的大肠杆菌工程菌。

一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌的蛋白表达，其特征在于：

由以下步骤实现：

1）将重组菌在LB固体平板上划线，34℃培养12h，转接于另一LB固体平板，34℃继续培养12h，得到活化的种子平板；

2）从种子平板上挑取单菌落，接种于含50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，34℃培养12h，转接于含50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，34℃培养6h，最后以1%-8%接种量接种于终容量为50ml培养基的250ml三角瓶中，34℃，220rpm培养，发酵生产类人胶原蛋白，在发酵到6h时，将温度提高到42℃诱导类人胶原蛋白表达，诱导3h，发酵到9h时将温度调为39℃，使菌体继续生长并继续表达类人胶原蛋白，发酵到12h-14h时发酵结束。

步骤2）中，所述培养基为专用发酵培养基，其配方为：葡萄糖 10-15g/L，酵母粉 10-12g/L，硫酸铵 5-6g/L，磷酸氢二钾8-9g/L，磷酸二氢钠4-5g/L，EDTA 1.0-1.5g/L，微量元素0.5-1.5ml，硫酸镁 1-2g/L，卡那霉素 0.0025-0.0035g/L，余量为水。

步骤2）中，所述培养基为M9培养基。

一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌的蛋白表达，其特征在于：

由以下步骤实现：

1）将重组菌在LB固体平板上划线，34℃培养12h，转接于另一LB固体平板，34℃继续培养12h，得到活化的种子平板；