[发明专利]表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列及其应用

权利要求书

1.一种表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列，其特征在于：如SEQ ID NO.1所示。

2.一种表达量高和活性强的CVN突变体，其特征在于：由权利要求1所述的编码序列制备得到。

3.根据权利要求2所述的的表达量高和活性强的CVN突变体，其特征在于通过如下方法制备得到：将权利要求1所述的编码序列克隆到表达载体上，得到重组载体；将重组载体转化到宿主细胞中进行表达，纯化，得到表达量高和活性强的CVN突变体。

4.根据权利要求3所述的的表达量高和活性强的CVN突变体，其特征在于：所述的表达载体为pET-28b；所述的宿主细胞为大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）。

5.权利要求1所述的表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列在制备CVN突变体中的应用，其特征在于包含如下步骤：

（1）设计如下的引物：

F-sumo：5’-GGAATTCCATATGGGCATGTCGGACTCAGAAGTC-3’；

R-CVN：5’-TTCCGCGGCCGCTATGGCCGACGTCGACTTCGTATTTCAGGGTACCGTC-3’；

F1-mutant：5’-GACGACCACATCGCTAACATAGACGGTACACTAAAATACGAATGATGAGTCGAC-3’；

R1-mutant：5’-GTCGACTCATCATTCGTATTTTAGTGTACCGTCTATGTTAGCGATGTGGTCGTC-3’；

（2）第一次PCR扩增：以pET-3c-SUMO-CVN质粒为模板，以F-sumo/R-CVN为引物进行PCR扩增，得到的PCR产物纯化后使用NdeI和SalI双酶切；将双酶切后的PCR产物与经过NdeI和SalI双酶切的载体pET-28b，连接；连接产物转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞，筛选，得到重组载体pET-28b-CVN；

（3）第二次PCR扩增：以pET-28b-CVN为PCR扩增模板，F1-mutant/R1-mutant为引物进行PCR扩增，得到的PCR产物纯化经DpnI酶切，cycle pure Kit试剂盒纯化的酶切产物直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选，得到重组载体pET-28b-CVN-M1；

（4）诱导表达：将重组载体pET-28b-CVN-M1转入大肠杆菌BL21（DE3），得到表达菌株；接着使用含有卡那霉素的LB培养基对该表达菌株于37℃、180～200rpm的条件下进行培养，在OD600=0.8时，加入IPTG，IPTG的终浓度为1mM，37℃诱导表达4h后，收集菌体；

（5）纯化：将菌体沉淀按体积比1：10比例重新悬浮于NTA-10缓冲液后对菌体进行破碎，离心，收集上清；上清上样Ni-NTA亲和层析柱中，首先使用NTA-10缓冲液洗回基线，再用NTA-40缓冲液洗杂蛋白，最后用NTA-200缓冲液洗脱，得到目的蛋白CVN突变体；其中，NTA-10缓冲液的组成为20mmol/L Tris-HCl、pH8.0+0.15mol/L NaCl+10mmol/L咪唑，NTA-40缓冲液的组成为20mmol/L Tris-HCl、pH8.0+0.15mol/L NaCl+40mmol/L咪唑，NTA-200缓冲液的组成为20mmol/L Tris-HCl、pH8.0+0.15mol/L NaCl+200mmol/L咪唑。

6.根据权利要求5所述的表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列在制备CVN突变体中的应用，其特征在于：步骤（2）中所述的PCR条件为94℃预变性3min；94变性1min、退火至55℃保持1min、68℃延伸2min，进行28个循环；68℃延伸5min；

步骤（3）中所述的PCR条件为94℃预变性3min；94变性1min、退火至55℃保持1min、68℃延伸12min，进行18个循环；68℃延伸5min；

步骤（4）中所述的卡那霉素的终浓度为50mg/L；

步骤（5）中所述的离心的条件为4℃、25000g、30min。

7.权利要求2所述的表达量高和活性强的CVN突变体在制备预防和/或治疗抗病毒药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的表达量高和活性强的CVN突变体在制备预防和/或治疗抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述的病毒为流感病毒或艾滋病毒。