[发明专利]表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列及其应用。

背景技术

蓝藻抗病毒蛋白N（cyanovirin-N，CVN）是Boyd等1997年在蓝藻中发现的一种抗病毒蛋白，能特异、高亲合性地结合与病毒表面衣壳蛋白gp120上的甘露寡糖结合，阻止病毒与宿主细胞表面的受体结合，并阻止病毒在感染细胞和正常细胞之间的传播，这一特点使它可以不受病毒变异的干扰，不易引起耐药性。CVN蛋白低浓度（0.1～36.8nM）能有效抑制HIV感染免疫细胞，高浓度（45～400nM）对正常细胞无直接的毒副作用。

除HIV外，CVN对流感病毒、疱疹病毒和副流感病毒等都有拮抗作用，是一种作用广谱、高效、非常有应用价值的抗病毒候选药物，备受关注。但是，CVN的大规模制备一直是限制其应用的瓶颈技术。目前报道CVN在大肠杆菌中都是以包涵体形式表达，受到表达量低、产物不均一、错误修饰等多种因素限制（Mori,T.,Gustafson,K.R.,Recombinant Production of Cyanovirin-N,a Potent Human Immunodeficiency Virus-Inactivating Protein Derived from a Cultured Cyanobacterium.Protein Expression and Purification,1998,151-158）；也有人尝试在转基因植物中表达CVN，但是没有建立可实施的纯化工艺(Sexton,A.,Drake,P.M.,Mahmood,Transgenic plant production of Cyanovirin-N,an HIV microbicide.2006,Vol.20pp.356-358)。

传统生化理论“安芬森原则”认为，蛋白质的折叠信息由其氨基酸序列在一定环境下唯一决定（Taniuchi H.,D.R.Davies,and C.B.Anfinsen,A comparison of the x-ray diffraction patterns of crystals of reconstituted nuclease-T and of native staphylococcal nuclease.J Biol Chem,1972.247(10):p.3362-4）。但本发明人的研究指出，这一传统理论有误。不同的DNA虽然可以翻译成同样的氨基酸，蛋白质生成的速度（翻译速度）并非恒定，在某些区段上会比较缓慢，这种现象称为翻译暂停（translational pausing或translational attenuation）翻译暂停位点与蛋白质折叠高度相关，若翻译暂停位点不正确，该慢的地方快了，或者该快的地方慢了，都将导致蛋白质错误折叠聚集，无法得到有功能的可溶性蛋白。也就是说，蛋白质空间构象不仅由氨基酸的序列决定，也由核苷酸序列决定。（Zhang G.,M.Hubalewska,and Z.Ignatova,Transient ribosomal attenuation coordinates protein synthesis and co-translational folding.Nat Struct Mol Biol,2009.16(3):p.274-80.；Zhang G.and Z.Ignatova,Folding at the birth of the nascent chain:coordinating translation with co-translational folding.Curr Opin Struct Biol,2011.21(1):p.25-31.）。这一理论适用于蛋白组中绝大部分蛋白质（Zhang,G.and Z.Ignatova,Generic algorithm to predict the speed of translational elongation:implications for protein biogenesis.PLoS One,2009.4(4):p.e5036.；Fedyunin,I.,et al.,tRNA concentration fine tunes protein solubility.FEBS Lett,2012.586(19):p.3336-40.）。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种表达量高和活性强的CVN突变体的编码序列。