[发明专利]一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法

权利要求书

1.一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，包括如下步骤：

（1）、工程菌发酵：

把分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的种子液接种到培养基体系中培养26～32小时，所述分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的种子液的加入体积为培养基体系体积的5%～10%；期间补充适量葡萄糖、蛋白胨和酵母提取物，发酵完成后发酵液离心收集菌体；

（2）、制备胞苷磷酸转移酶清液：

取上述菌体悬浮在磷酸缓冲液中用超声波或匀浆仪破碎，获得破碎液，在上述破碎液中加入硫酸铵进行盐析，获得饱和度为25%～45%盐析液，再用孔径为100～500nm的陶瓷膜过滤器将上述盐析液固液分离，得胞苷磷酸转移酶清液，其中，所述菌体与所述磷酸缓冲液的悬浮比例为1：4～1：10；

（3）、胞苷磷酸转移酶清液的固定化：

上述胞苷磷酸转移酶清液中加入固定化载体，搅拌固化，获得固定化胞苷磷酸转移酶，所述固定化载体的加入量与胞苷磷酸转移酶清液的比例为100～200克/L；

（4）、胞磷胆碱钠的合成：

将含三磷酸胞苷二钠30～80mmol/L、磷酸胆碱60～400mmol/L以及乙酸镁10～50mmol/L的水溶液混合配制成合成反应液，调节合成反应液的pH值至6.0～9.0，加入所述固定化胞苷磷酸转移酶，并在10～50℃的水浴温度下搅拌反应4～10小时，过滤后得到的清液即为胞磷胆碱钠液，所述固定化胞苷磷酸转移酶的加入量与合成反应液的比例为10～50g/L；

（5）、提取纯化：

将上述胞磷胆碱钠液经层析分离结晶干燥，得到胞磷胆碱钠的干品。 

2.根据权利要求1所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，所述培养基体系中含有蛋白胨10～20g/L，酵母提取物10～20g/L，葡萄糖5～8g/L，无机盐8～15g/L，余量为纯化水。

3.根据权利要求2所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，工程菌发酵发酵过程中，期间补充的葡萄糖的量为培养基体系中含有的葡萄糖的量的10-15倍，补充的蛋白胨的量为为培养基体系中含有的蛋白胨的量的50-80%，补充的酵母提取物的量为为培养基体系中含有的酵母提取物的量的50-80%。

4.根据权利要求3所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，所述固定化载体选自纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、多聚氨基酸、聚苯乙烯、尼龙或多孔玻璃载体的任一种。

5.根据权利要求4所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，所述固定化载体中含有芳香氨基或羟基或羧基或羧甲基或环氧基或氨基功能基团中的至少一个基团。

6.根据权利要求5所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，胞磷胆碱钠的合成的步骤中，固定化胞苷磷酸转移酶10～50g/L，三磷酸胞苷二钠为30～80mmol/L；磷酸胆碱60～400mmol/L；乙酸镁10～50mmol/L；反应温度25～40℃；pH值为6.0～9.0。

7.根据权利要求6所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，胞磷胆碱钠的合成的步骤中，固定化胞苷磷酸转移酶含量为20～30g/L,三磷酸胞苷二钠为40～60mmol/L；磷酸胆碱120～240mmol/L；乙酸镁20～30mmol/L；反应温度30～40℃；pH 值为6.5～8.0。