[发明专利]一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及制药领域，具体是指一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法。

背景技术：

胞磷胆碱钠又称胞二磷胆碱钠，化学名胆碱胞嘧啶核苷二磷酸酯的单钠盐，一种脑代谢激活剂，为核苷衍生物，是磷酯酰胆碱的前体物质，是卵磷脂合成所必需的辅酶，于1954年发现，1956年合成，1973年国内试制成功。

胞磷胆碱钠的药理作用主要有：可恢复脑细胞损伤后细胞膜的结构，增强细胞膜的功能，改善神经元的功能；降低脑血管阻力，增加脑血流量，促进脑代谢，改善脑循环，提高脑功能；增加包括乙酰胆碱和多巴胺在内的神经传导介质的分泌，增强与意识有关的脑干网状结构功能，改善头部外伤后或脑手术后意识障碍的意识状态及脑电图，促进脑卒中偏瘫病人的上肢运动功能的恢复，对促进大脑功能恢复、促进苏醒有一定作用；促进卵磷脂生物合成和抗磷脂酶A作用，从而加速脑水肿的重吸收。增进多巴胺能活动，调控锥体外系的生理功能。与蛋白分解酶抑制剂合用，可保护及修复胰腺组织。

临床上胞磷胆碱钠主要用于急性颅脑外伤和脑手术后意识障碍，治疗帕金森氏综合症(Parkinson’s disease)；神经性耳聋；对老年性痴呆症(Alzheimer’s disease )、抑郁症、延缓衰老，提高学习效果和记忆力等有一定的疗效。

胞磷胆碱钠的生产方法包括化学合成法，微生物发酵法及酶促合成法三种方法。化学合成法，以胞苷酸（CMP）、磷酸胆碱（CP）为底物, 用对甲苯磺酰氯为缩合剂，在N-二甲基甲酰胺(DMF)存在下缩合成胞磷胆碱钠，化学合成存在反应转化率低，副产物多，生产成本高，环境污染严重等问题；微生物发酵法是用酵母菌或产氨短杆菌等微生物利用葡萄糖，并添加CMP、CP等前提物发酵生成胞磷胆碱钠，微生物发酵法存在产物浓度低，产率不稳定等问题；酶促合成法曾有以豚鼠肝细胞匀浆提抽胞苷磷酸转移酶，并催化CTP与磷酸胆碱生成胞磷胆碱钠的初步报道，但因酶的来源问题，酶促合成法无法实现。

发明内容：

本发明的目的是提供一种旨在解决化学合成法，微生物发酵法及酶促合成法生产胞磷胆碱钠的种种缺陷，生产工艺简单，生产周期短，生产成本低，能广泛应用于胞磷胆碱钠的产业化生产的酶催化合成胞磷胆碱钠的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，包括如下步骤：

（1）、工程菌发酵：

把分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的种子液接种到培养基体系中培养26～32小时，所述分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的种子液的加入体积为培养基体系体积的5%～10%；期间补充适量的葡萄糖、蛋白胨以及酵母提取物，发酵完成后发酵液离心收集菌体。

（2）、制备胞苷磷酸转移酶清液：

取上述菌体悬浮在磷酸缓冲液中用超声波或匀浆仪破碎，获得破碎液，在上述破碎液中加入硫酸铵进行盐析，获得饱和度为25%～45%盐析液，再用孔径为100～500nm的陶瓷膜过滤器将上述盐析液固液分离，得胞苷磷酸转移酶清液，其中，所述菌体与所述磷酸缓冲液的悬浮比例为1：4～1：10。

（3）、胞苷磷酸转移酶清液的固定化：

上述胞苷磷酸转移酶清液中加入固定化载体，搅拌固化，获得固定化胞苷磷酸转移酶，所述固定化载体的加入量与胞苷磷酸转移酶清液的比例为100～200克/L。

（4）、胞磷胆碱钠的合成：

将含三磷酸胞苷二钠30～80mmol/L、磷酸胆碱60～400mmol/L以及乙酸镁10～50mmol/L的水溶液混合配制成合成反应液，调节合成反应液的pH值至6.0～9.0，加入固定化胞苷磷酸转移酶，并在10～50℃的水浴温度下搅拌反应4～10小时，过滤后得到的清液即为胞磷胆碱钠液，所述固定化胞苷磷酸转移酶的加入量与合成反应液的比例为10～50g/L。

（5）、提取纯化

将上述胞磷胆碱钠液经层析分离结晶干燥，得到胞磷胆碱钠的干品。

其中，所述分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所保藏编号为CGMCC  NO：4428。