[发明专利]鉴定大葱细胞质育性的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物农业领域，具体而言，涉及鉴定大葱细胞质育性的方法及试剂盒。 

背景技术

大葱(Allium fistulosum L.var.giganteum Makino)属于两年生草本植物，完成一个生命周期约需两年时间，且大葱花器小，单花结籽率低，人工去雄成本高，因而利用传统方法选育大葱杂交种，周期长，效率低，这也是目前限制大葱杂交种选育的重要原因。大葱自然雄性不育株率较高，其不育性可以遗传，可用于大葱杂交育种(张启沛，1987；马上武彦，1985)。因此，利用雄性不育系进行大葱杂交种的研制，是一种行之有效的途径，然而在利用雄性不育系选育杂交种的过程中，保持系的选育工作又成为杂交育种亟需解决的关键问题之一。利用分子标记辅助选择体系进行保持系辅助选择不受环境条件的限制，可实现苗期选择，减少工作量，加快育种进程。大葱细胞质育性分子标记的开发工作，不仅成为利用分子标记辅助育种的前提，也是建立新型的大葱杂交育种选择体系的重中之重。但是，对于大葱雄性不育分子标记辅助育种的研究却鲜见报道，无可供借鉴的成熟技术。 

为加快大葱雄性不育系选育进程，盖树鹏以章丘大葱不育系与保持系为材料，对大葱细胞质线粒体DNA进行了RAPD标记，并成功获得了两个能够鉴定部分大葱品种细胞质育性的RAPD标记，并将其中一个RAPD标记成功转化为SCAR标记，现有技术报道了该片段大小约为2800bp，两端序列已公开，但中间片段未见报道。另一方面，提取线粒体DNA的复杂性也限制了这一标记的广泛应用。另外，此标记为S型细胞质特异标记，只能够进行单株选择，而不能进行群体选择。 

植物育种中分子标记辅助选择是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记来判断目标基因是否存在的。通过不同分子标记技术的分析可筛选出与目标基因性状紧密连锁的DNA片段，这样可以作为辅助育种的分子标记。应用这些分子标记进行苗期选择，将得到事半功倍的作用，因为分子标记辅助选择不受植物生长发育的时期及环境的影响，不存在表达与否的问题。无论是与细胞质位点还是与核基因连锁的标记的辅助选择都可减少工作量，提高育种效率。我们在筛选保持系时，一般只需要将100株或者50株混合提取总DNA样品进行简单PCR扩增，若只出现N型标记，说明此群体中都是N型细胞质类型，若既有N型标记，也有S型标记，说明此群体含有两种类型的细胞质，然后依次缩小群体范围；若只出现S型标记，即使耗费再多的时间和精力，也不可能得到保持系。因此S/N共显性标记能节省大量的人力和财力。 

发明内容

本发明涉及一种鉴定大葱细胞质育性的方法，其特征在于包括如下步骤： 

(1)提取待鉴定大葱基因组DNA 

(2)采用如下引物扩增大葱基因组DNA： 

正向引物：5′TAATGGAGGCGGTCTTCGTG3′ 

反向引物：5′TAGGCTTTGGTATTTGTTGC3′； 

(3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物多态性，在自动凝胶成像系统上观察扩增产物的片段长度，根据片段长度判断大葱细胞质育性。 

在本发明的一个优选实施方式中，采用CTAB法提取大葱基因组DNA； 

在本发明的一个优选实施方式中，所述的片段长度通过凝胶电泳和/或测序的方法进行。 

在本发明的另一个优选实施方式中，进行群体鉴定：例如将50-100株混合提取总DNA进行简单PCR扩增，若只出现327bp的片段，说明此群体中都是N型细胞质类型，若只出现1412bp的片段，说明此群体中都是S型细胞质类型；若同时出现327bp的片段和1412bp的片段，说明此群体含有两种类型的细胞质，依次缩小群体范围继续鉴定。 

本发明另一方面涉及一种鉴定大葱细胞质育性的试剂盒，其特征在于包括如下引物： 

正向引物：5′TAATGGAGGCGGTCTTCGTG3′ 

反向引物：5′TAGGCTTTGGTATTTGTTGC3′。 

本发明获得了鉴别大葱细胞质育性相关基因的一个稳定SCAR共显性标记。本发明的大葱细胞质育性鉴定的SCAR共显性标记在大葱不育系的相应保持系的选育中具有广泛应用，可以进行群体选择，极大地节约了人力物力和财力，提高大葱杂交育种效率。