[发明专利]一种制备抗体-美登素类生物碱药物偶联物的方法

权利要求书

1.一种抗体-美登素类生物碱药物偶联物的制备方法，包括以下步骤：

（1）抗体置换缓冲液

利用超滤浓缩或者脱盐层析的方式置换抗体原液至反应缓冲液中，反应缓冲液中含有0.02%～0.1%v/v的表面活性剂，浓缩至抗体浓度在20～30mg/ml；得置换后的抗体；

所述的抗体原液单克隆抗体的原液；

（2）制备美登素生物碱类药物母液

取连接有双功能连接剂的美登素生物碱类药物，即双功能连接剂-美登素生物碱，用有机溶剂溶解，制备含有10mg/ml美登素生物碱药物的母液；

优选的，所述美登素生物碱为DM1或DM4；

（3）偶联反应

按双功能链接剂-美登素生物碱与抗体的摩尔比为5～6:1的比例，将第（1）步中得到的置换后的抗体与第（2）步中得到的美登素生物碱母液混合，进行偶联反应，反应温度20～30℃，反应时间1～4小时；

（4）阴离子交换层析

将上述反应液上样至阴离子交换层析柱进行纯化；首先用平衡缓冲液平衡阴离子层析柱，然后上样，层析柱载量为30-50mg/ml，上样流速为75-100cm/h，收集流穿液，上样完毕后，再用平衡缓冲液冲洗阴离子层析柱，直至收集完毕；

（5）脱盐层析

将上述阴离子交换层析收集的流穿液进行Sephadex^TM G25脱盐层析柱纯化；脱盐缓冲液平衡脱盐层析柱，脱盐缓冲液含有0.02～0.1%v/v的表面活性剂，将阴离子交换层析的收集液上样至脱盐层析柱，流速为2～5cm/h，收集第一个出峰样品，即为所制备的抗体-美登素生物碱类药物偶联物。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）所述的抗体原液选自曲妥珠单抗、西妥昔单抗或帕尼单抗。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）所述的置换抗体原液的反应缓冲液选自磷酸钠盐缓冲液、磷酸钾盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液或者磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，缓冲液pH6.0～9.0。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）所述的超滤浓缩或者脱盐层析的方式可以采用现有技术，例如可以通过Pellicon系统进行超滤浓缩，或采用Sephadex^TMG25凝胶层析柱进行脱盐层析。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）所述的表面活性剂为司盘40、司盘60、吐温20、吐温40、吐温60和吐温80。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（2）所述的有机溶剂选自二甲基乙酰胺（DMA）、二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）或乙醇（EtOH）。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（3）所述的双功能连接剂选自N-琥珀酸酰亚胺基4-（马来酰亚胺甲基）环己烷羧酸酯（SMCC）、N-琥珀酸酰亚胺基4-（马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧基-（6-酰氨基己酸酯）（LC-SMCC）。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（4）所述的阴离子交换层析的层析介质选自Q Sepharose、DEAE Sepharose、Capto Q、Capto DEAE或Capto Adhere；

优选的，步骤（4）所述的阴离子交换层析所用的平衡缓冲液与步骤（1）所用的反应缓冲液相同。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（5）所述的脱盐层析使用的脱盐缓冲液选择柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸缓冲液或磷酸盐缓冲液，缓冲液中含有0.02%～0.1%v/v的表面活性剂；所述表面活性剂与步骤（1）的表面活性剂相同。

10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤如下：

（1）利用Sephadex^TM G25色谱柱纯化脱盐层析方式置换曲妥珠单抗原液至反应缓冲液，反应缓冲液组成为0.1M磷酸钠盐，pH7.5,含0.05%v/v的吐温20；浓缩抗体浓度至20mg/ml，制得置换的曲妥珠抗体；

（2）称取SMCC-DM1，用二甲基乙酰胺（DMA）充分溶解制备10mg/ml的SMCC-DM1母液；

（3）按SMCC-DM1与抗体的摩尔比为5～5.5:1，在步骤（1）所制备的曲妥珠单抗中加入步骤（2）配制的SMCC-DM1母液，开始偶联反应，反应温度为25℃，反应时间为1.5h；

（4）将上述反应液上样Capto Adhere阴离子交换层析柱。层析柱先用步骤（1）中相应的反应缓冲液进行平衡，然后将步骤（3）反应完毕后的反应液上样，流速为75cm/h，载量为35mg/ml，收集流穿样品，上样完毕后，用相应的反应缓冲液冲洗，至收集完毕；

（5）将上述经阴离子交换层析的收集液分别进行Sephadex^TM G25脱盐层析。脱盐层析柱先用脱盐缓冲液平衡，流速为3cm/h。所用的脱盐缓冲液为20mM琥珀酸，0.05%吐温20，pH5.5；上样完毕后，用同样的缓冲液冲洗，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品，即为制备的曲妥珠-SMCC-DM1偶联物。