[发明专利]一种制备抗体-美登素类生物碱药物偶联物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗体-美登素生物碱类药物偶联物的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

随着靶向治疗药物的开发，癌症的治疗取得了显著的进步。近几年来，研究人员利用癌细胞表面选择性表达的细胞受体和抗原，开发了许多抗体药物，这些抗体可以与肿瘤细胞进行特异性结合。在此基础上，将细胞毒素分子，比如细菌和植物毒素、放射性核素和某些化学治疗药物与抗体进行化学连接，得到抗体-药物偶联物，这类抗体-药物偶联物在与肿瘤细胞结合后释放药物或激活药物的细胞毒活性，将肿瘤细胞杀灭。抗体-药物偶联物的特异性可以降低对正常细胞的毒性，因此提高了药物在患者体内的耐受性。

美登素（Maytansine）首先是由Kupchan等人从东非灌木齿叶美登木（Maytenus serrata）中分离出来。美登素生物碱是一类高度细胞毒性的药物，据研究，它的毒性要比传统的癌症化疗药物如甲氨蝶呤、柔红霉素等的细胞毒性要强100至1000倍，参见US3896111。之后，发现一些微生物也可以产生美登素生物碱，如美登木醇（maytansinol）和美登木醇的C-3酯，参见US4151042。

美登素是有丝分裂抑制剂，已报道，用美登素处理的L1210细胞，导致67%的积累在有丝分裂期，而未被处理的对照细胞显示范围在3.2%至5.8%之间。用海胆卵和蛤卵的研究显示，美登素通过抑制微管蛋白的聚合而干扰微管的形成，从而抑制有丝分裂。参见Remillard，189Science1002-1005（1975）。

由于美登素生物碱的高度细胞毒性，预示它们在治疗癌症中有作用，不过，美登素生物碱的临床试验并不令人满意，主要是由于它们的副作用。对中枢神经系统和胃肠症状的副作用导致患者拒绝进一步治疗，并且美登素生物碱似乎和周围神经病相关，该周围神经病可能是累积的（Issel at207）。

通过制备抗体-美登素生物碱偶联物可以定向将药物传送至靶细胞位点，从而降低对正常组织和细胞的毒性，降低美登素生物碱的副作用。

CN101087611A报道了用不可切割接头连接抗体与美登素生物碱制备的偶联物和用可切割接头连接抗体与美登素生物碱制备的偶联物相比，两者具有相同的体外和体内抗肿瘤活性，但是前者在血浆清除率和毒性方面显示了显著的降低。

US5208020和US5416064等公开了制备抗体-美登素生物碱偶联物的方法，首先用双功能连接剂与单克隆抗体偶联，利用Sephadex^TM G25色谱柱纯化连接上连接剂的单克隆抗体，再将连接有连接剂的单克隆抗体与过量的含巯基的化学毒素偶联，再次利用Sephadex^TM G25色谱柱纯化。

CN101087611A也公开了与US5208020、US5416064相同的方式制备抗体-美登素生物碱偶联物的方法，即先将双功能连接剂与单克隆抗体偶联，纯化获得第一混合物，再与化学毒素偶联，进行纯化获得偶联物。利用这种方式获得的抗体-药物偶联物纯度低并且不稳定。例如，CN101087611A实施例中公开的曲妥珠-SMCC-DM1偶联物的纯度只有95%左右，并且蛋白聚体物的含量占到了4.2%以上，这种高聚物的存在在治疗过程中存在引起较高免疫源性的风险。

CN102596922A公开了一种新的双功能连接剂，即在传统的双功能连接剂上并入亲水性的PEG间隔物将其修饰为亲水性连接体。利用这种连接剂偶联得到的抗体-药物偶联物可以允许每个抗体分子偶联最多15个药物分子，从而提高了连接效率。同时，也公开了一种新的抗体-药物偶联的方法，即先将双功能连接剂和化学药物连接，在将其和单克隆抗体连接。利用这种偶联方法减少了偶联中的纯化步骤，提高了产物收率，同时也大大降低了抗体-药物偶联物的异质性。但是，利用该专利文件公开的方案合成亲水性的双功能连接剂是一件比较繁琐的化学反应过程，可能会限制此种双功能连接剂的应用。且CN102596922A公开的偶联方法合成曲妥珠-SMCC-DM1，利用TSK-GEL尺寸排阻层析（流动相含有15%的异丙醇，可以更好的将偶联物单体与聚体分开）分析发现仍然含有高达4%的偶联物聚体。并且，为了获得合适偶联率，即偶联物中药物与抗体的摩尔比，一般需要在反应时加入6-10倍过量的药物，例如，在曲妥珠-SMCC-DM1制备中，需要投入7-9倍过量的药物，一般在7.5-8.5倍之间，使成本增加。

发明内容