[发明专利]一种快速检测黄牛SIRT1基因SNP的RFLP方法

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种快速检测沉默调节因子1(SIRT1)基因单核苷酸多态性(SNP)的RFLP（限制性片段长度多态性）方法，具体地说，是一种利用限制性内切酶对包含该单核苷酸多态性位点的基因序列进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳对其进行片段大小分离，利用凝胶成像系统分析其片段大小，从而确定其SNP。

背景技术

单核苷酸多态性（SNP）就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A/T/C/G）的替换而引起的多态性。SNP属于第三代分子标记，具有密度高、双等位基因、易实现自动化检测等优点，由于SNP具有其它标记无比拟的优点，所以它作为一种研究工具已经在生命科学的各个领域得到广泛应用。

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、直接测序技术和PCR-RFLP等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判，而直接测序技术成本又较高。PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

SIRT1是酵母染色质沉默因子SIR2（silent information regulator2）的哺乳动物同源体，是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的组蛋白脱乙酰酶。SIRT1在成熟组织中广泛表达，在胚胎早期和生殖细胞中含量尤其丰富，参与调节机体内许多生理功能，包括众多基因转录、能量代谢以及细胞衰老过程的调节等，尤其在糖代谢、脂代谢、调节胰岛素分泌中发挥着重要的作用。在脂肪组织中SIRT1负调控白色脂肪细胞中的过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activated receptors，PPARγ)，促进脂肪动员。在成肌细胞中，降低内源SIRT1导致肌细胞标志基因表达增加，促进肌细胞分化。对于黄牛育种来讲，分析SIRT1基因在牛脂肪代谢及肌肉分化中的机制，对于提高黄牛的育肥效率、提高肉品质具有重要的理论意义。

目前国内外未见关于牛SIRT1基因遗传变异的研究，由于SIRT1基因功能涉及脂肪代谢及肌肉分化等重要生长性状，本发明提供的检测方法为SIRT1基因的SNP与中国黄牛生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

发明内容

本发明解决的问题在于利用PCR-RFLP方法检测黄牛SIRT1基因启动子区的单核苷酸多态性，分析其对SIRT1基因启动子活性的影响，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。

本发明是通过以下技术方案来实现：

以黄牛血液全基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、Buffer(缓冲环境)、Mg^2＋、dNTPs存在的情况下，利用引物F、R进行PCR扩增，然后用限制性内切酶对其进行酶切，再通过3.0%琼脂糖凝胶电泳检测即可鉴定SIRT1基因转录起始位点上游274位（-274位，即SEQ ID NO.1第127位）的单核苷酸多态性。

所述的PCR扩增引物为：

上游引物F：5′-GTATAGTCCACGGGGTTACAG-3′，

下游引物R：5′-CCAAACTTGTCTTTCAGAGTC-3′。

所述的PCR扩增条件是:25μL反应体系包括1U Taq DNA聚合酶(MBI,Fermentas)，10×Buffer2.5μL(MBI,Fermentas)，25M MgCl₂1.5μL(MBI,Fermentas)，2.5mM dNTPs2.5μL，50ng黄牛血液基因组DNA，10μM的上、下游引物各0.25μL和灭菌超纯水15.0μL；

所述的PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸10min；

所述的限制性内切酶为SmaI，10μL SmaI酶切体系为：权利要求2中的PCR产物5μL，10×T Buffer1.0μL，0.1%BSA1.0μL，SmaI(10U/μL)0.5μL，ddH₂02.5μL，酶切消化条件：30℃恒温水浴5～8h。

所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.0%。