[发明专利]一种肠出血性大肠杆菌快速检测方法

权利要求书

1.一种肠出血性大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

免疫抗原的制备；免疫小鼠；抗体的纯化；胶体金试纸条的制备。

2.如权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，免疫抗原的制备是将二代肠出血性大肠杆菌菌株制备成菌悬液。

3.如权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，免疫小鼠的方法为：选用6-8周的BalB/c小鼠，初次免疫菌悬液与弗氏完全佐剂混合，乳化完全，皮下多点注射，1ml/每只，每隔两周，用相同剂量的菌悬液与弗氏不完全佐剂进行加强免疫，共加强免疫两次，最后一次免疫后8-10天小鼠尾部取血，通过间接ELISA测抗体血清效价，则进行小鼠眼部取血。

4.如权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，抗体纯化的方法为：将血清置于Protein G亲和层析柱(KPL)柱吸附琼脂的表面，用10倍柱体积1×Washing/Binding Buffer洗吸附柱，用4倍柱体积的1×Elution Buffer洗脱，得到肠出血性大肠杆菌特异性抗体。

5.如权利要求4所述的肠出血性大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，1×Washing/Binding Buffer为0.1M磷酸钠缓冲液，0.15MNaCl，pH7.4洗吸附柱；1×Elution Buffer为0.2M甘氨酸，pH2.5。

6.如权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，胶体金试纸条制备的具体步骤为：

步骤一，胶体金的制备：利用冷凝回流装置将50mL质量分数为0.01％的氯金酸溶液加热至沸腾后迅速加入质量分数为1％的柠檬酸三钠溶液1.2mL，待颜色稳定后继续煮沸10min，冷却，4℃保存备用，利用投射电镜和紫外光谱扫描仪分析胶体金的性状；

步骤二，标记条件的选择：在酶标板孔中分别加入胶体金100μL，而后依次从少到多加入0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5μg的肠出血性大肠杆菌特异性抗体，混匀10min后各加入10％NaCl溶液20μL，于10min后肉眼观察反应结果，第一个保持不变颜色的孔的抗PBP2a单克隆抗体加入量即为最少稳定量，最少稳定量增加10％左右为实际标记量，取三支1.5mL离心管各装胶体金1mL，用0.1mol/L HCl和K₂CO₃分别调pH为7.2、8.2、9.2，加入最佳标记抗体量，对比标记效果；

步骤三，免疫胶体金制备：取10mL胶体金于三角瓶中，用K2CO3调pH为最佳标记条件，加入最佳标记抗体量，RT搅拌反应30min，得免疫胶体金，8000rpm离心30min，用1mLPBS复溶免疫胶体金备用，将制备好的免疫胶体金喷涂在玻璃纤维膜上制成胶体金垫；

步骤四，层析NC膜的制备：将羊抗鼠二抗C线和肠出血性大肠杆菌多克隆抗体T线分别划在NC膜上，制成层析NC膜；

步骤五，纸条的组装：取一张PVC底板，在离上方18mm处贴上20mm宽的硝酸纤维膜，上方贴上19mm宽的吸水纸，压上硝酸纤维膜1mm，硝酸纤维膜下方贴上结合垫，结合垫压硝酸纤维膜1mm，胶体金垫下面贴上玻璃纤维膜，压上胶体金垫3mm，下端与底板对齐。