[发明专利]一种肠出血性大肠杆菌快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测领域，尤其涉及一种肠出血性大肠杆菌快速检测方法。

背景技术

大肠杆菌是一种革兰氏阴性短杆菌，长约2*10-3cm，宽约0.5*10-3cm，体积约为0.6-0.7*10-6cm周身鞭毛大约每个菌细胞有4一6根鞭毛能运动无芽孢。大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、钱盐、葡萄糖的普通培养基上生长大肠杆菌的卫生标准大肠杆菌大量存在于人及其他恒温动物体内的肠道内，常随人及动物粪便一块排出，广泛传播于自然环境中，对水源造成污染。若在水和食品中检出，可认为是被粪便污染的指标。大肠杆菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久，这些特性使他们可以作为一个理想的生物测试环境样品的粪便污染指示物，因此，大肠杆菌的检测已成为环境微生物学中重要的检测项目之一。目前，世界各国及国际组织都将大肠菌群数作为重要环境卫生学指标，并对其提出了严格的限制。世界卫生组织《饮用水水质标准》(第二版)中规定，所有用于饮用的水中大肠杆菌或耐热大肠菌在任意100mL水样中不得检出；现行美国饮用水水质标准国家一级饮用水标准规定总大肠菌群为cfu/ml；中华人民共和国国家标准《生活饮用水水质卫生规范》规定，总大肠菌群及粪大肠菌群每100mL水样中不得检出。

大肠杆菌的最适生长温度为37℃，在42℃并4℃条件下也可生长，有些实验室菌株在高达49℃下仍能繁殖。大肠杆菌兼性厌氧，其最适生长的pH值范围为6.8一8.0。在酸性发酵的厌氧条件下，大肠杆菌可以产生乳酸，琥珀酸，乙醇，乙酸和二氧化碳等。

检测大肠杆菌的传统方法包括多管发酵法和滤膜法。

多管发酵法适用于各种样品，但操作复杂，检测时间较长；滤膜法主要用于检测杂质较少的水样，操作比多管发酵法更为简单。但是这两种方法都具有检测周期长，程序繁琐的缺点，难以适应污染源快速诊断的需要。

多管发酵法：

食品中大肠茵群数常以每100ml(g)检测样品内大肠菌群最近似数(MPN)来表示。大肠菌群的测定，一般应包括发酵试验(在单料或双料乳糖胆盐发酵管内进行)、分离培养试验(利用伊红美蓝平皿分离)、复发酵试验(在乳糖发酵管中进行)、革兰氏染色、芽抱染色、显微镜观察等试验操作。

大肠杆菌多管发酵法是指多管发酵法大肠菌群阳性，在含有荧光底物的培养基上44.5℃培养24h，能产生β一葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征性荧光，以此来检测水中大肠杆菌的方法。多管发酵法是对样品中活菌浓度的一种估计值。

当混勾的样品通过一系列稀释和等量分配成为小样品时，有些小样品中最后喊样品量少，以至其中不再含有需检验的细菌。在一定的小样品中存在或不存在细菌，可被用来对原样品的菌数作统计学估计。多管发酵法就是这样一种将样品“多次(管)稀释至无菌”的计数方法。在此方法中，将3个稀释梯度的检样稀释液接种于9支或巧支试管培养基中，每个稀释度接种3支或5支。经培养后，根据结果查阅MPN检索表，就可得到原样品中微生物的估计数量。

多管发酵法尤其适用于带菌量极少、其他方法不能检测的食品。比如水、乳制品及其他食品中大肠菌群的计数测定。在对一个产气肠杆菌纯培养物作计数时，应采用选择性平板计数法而不要用多管发酵法。如果待检测的样品是以其他细菌为主的河水，就应选用多管发酵法。

食物上细菌的分布有可能是完全均匀的，也有可能存在于固态食物的表面上，或者有可能分布在食物的特定的污染点，或是在全部食物中随机分布的定位的污染点上。MPN表中所列的值是假定所检验的细菌在样品或检样稀释液中呈均匀分布而计算出来的。而食物中的脂肪和不溶性食物颗粒妨碍了均一性，由于这个原因，由食物样品中所得到的MPN值，比之由水样中所得到MPN值的精确度和可重复性就要差一些。

滤膜法：

针对大肠菌群的滤膜法是指用孔径为0.45pm的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在添加乳糖的选择性培养基上37℃培养24h，能形成特征性菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌以检测水中大肠菌群的方法。采用滤膜过滤器过滤水样，将水中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜放在品红硫酸钠培养基上进行培养，因大肠菌群可以发酵乳糖，在滤膜上出现紫红色具有金属光泽的菌落。直接计数滤膜上生长的典型大肠菌群茵落，可计算出每升水样中含大肠菌群数。如果有必要，对可疑菌落应进行涂片染色镜检，并再接种乳糖发酵管进一步鉴定。