[发明专利]加强了toyB表达的重组淀粉酶产色链霉菌及构建方法与用途

说明书

技术领域

本发明涉及通过加强toyB基因在淀粉酶产色链霉菌的表达提高丰加霉素产量，属于基因工程技术领域。

背景技术

丰加霉素是一种新型核苷类抗生素，分子式为C₁₂H₁₃N₅O₄，核糖C₁连接类似鸟嘌呤的脱氮杂嘌呤环，核心结构为吡咯嘧啶核苷类似物。作用机理主要是通过抑制微生物的转录而影响菌体的生长，其生物活性研究报道主要集中在临床医学领域。近期有研究发现丰加霉素对多种植物疫病具有良好的防治效果，长期使用不会造成环境污染，而且对植物生长也具有一定的调节作用。因此，丰加霉素在农业植物病害防治领域具有的应用潜力。相对于化学合成法，生物法合成丰加霉素以可再生资源为原料，具有反应条件温和、污染少以及成本低廉等优点，因此，生物合成法是目前丰加霉素工业化生产比较经济有效的方法。

丰加霉素属于次级代谢产物，合成途径复杂，受到多种因素的限制与调控，导致丰加霉素合成水平较低，难以规模化生产。解决该问题的现有办法一般都是通过传统的诱变育种作为主要手段筛选高产优质的生产菌株，但筛选到高效菌株的不确定因素多、周期长。

如何利用分子生物学等先进的技术手段改良微生物进一步提高丰加霉素的产量成为一条可行的思路。McCarty等人以一株合成丰加霉素菌株Streptomyces rimosus (ATCC14673)为起始研究对象，克隆了生物合成丰加霉素基因簇，阐明了丰加霉素的合成过程及调控机制，研究发现丰加霉素由GTP为前体，经多步反应合成丰加霉素，其中由toyB基因编码的6-丙酮酰基四氢蝶呤合成酶是代谢途径的关键酶之一。但是利用代谢工程技术通过增加丰加霉素代谢通量而进一步提高丰加霉素产量因为涉及表达体系的建立等复杂问题未见相关报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌工程菌的构建及其用途。

淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628是一株拮抗放线菌，其发酵液对多种植物病原真菌具有较强的抑制作用，经分离提取，确定其主要有效成分为丰加霉素，尚未见淀粉酶产色链霉菌的代谢工程分子改造方面的的研究报道。

本发明首先从以淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628 (菌株的保藏编号为CGMCC NO. 2060)中首次克隆出编码6-丙酮酰基四氢蝶呤合成酶的toyB基因，并将该基因与链霉菌整合表达型质粒pIB139连接，成功构建了携带toyB基因的重组载体pIB139-toyB，并利用接合转移法将其特异性的整合在淀粉酶产色链霉菌1628染色体上。

一种淀粉酶产色链霉菌的toyB基因，他的序列如SEQ ID NO:1 所示。

一种加强了toyB表达的重组淀粉酶产色链霉菌，它表达了生物合成丰加霉素的关键酶-6-丙酮酰基四氢蝶呤合成酶编码基因toyB，具有比淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628更高的丰加霉素表达能力。

所述的原始菌为淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628。

所述的6-丙酮酰基四氢蝶呤合成酶编码基因toyB来自于待重组的原始菌淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)。

所述的6-丙酮酰基四氢蝶呤合成酶编码基因toyB整合入原始菌淀粉酶产色链霉菌染色体。

所述的加强了toyB表达的重组淀粉酶产色链霉菌的构建方法，其特征在于，过程如下：

1)构建表达载体pIB139-toyB； 

2)利用接合转移法将所述的表达载体整合入淀粉酶产色链霉菌染色体，获得所述的工程菌。

利用pIB139载体上的启动子permE*启动toyB基因的表达，利用接合转移法将载体pIB139-toyB特异性的整合入淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628的染色体，获得了遗传稳定的工程菌。