[发明专利]重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的制备方法

权利要求书

1.一种重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的制备方法，其包括如下步骤：使用上游引物(5’-CG GGA TCC GTG AGA GAA AGA GGT C-3’)和下游引物(5’-CCC CCA GGT CAG TTA GC-3’)，以TRAIL全长cDNA序列为模板进行PCR扩增，PCR产物记为TRAIL_114-281；

将TRAIL_114-281和载体pET-28a(+)使用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切回收后连接构建重组表达质粒pET-28a(+)-TRAIL_114-281，将其转化大肠杆菌E.coli DH5α中，通过酶切鉴定筛选出阳性转化子，将测序验证的重组质粒pET-28a(+)-TRAIL_114-281转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，培养后挑取单个菌落，接种到含卡那霉素(Kan)的LB培养基中培养过夜；次日将过夜的菌液接种于LB中，加入卡那霉素，36-38℃培养，当菌体密度OD值为0.5-0.7时，加入诱导剂IPTG和硫酸锌，24-26℃培养3-5h，取出菌液，离心收获湿菌；

湿菌加入包含8-12％甘油，0.3-0.6mol/L NaCl，10-30mmol/L tris-Hcl，4-6mmol/L DTT，0.5-1.5mmol/L PMSF的缓冲溶液，超声裂解细菌，离心，收获上清，过滤除去杂质，加入咪唑使其终浓度为15-25mmol/L，采用亲和层析法镍柱纯化TRAIL蛋白，用400-600mmol/L咪唑溶液洗脱，收集洗脱液并置于PBS缓冲液中0-4℃透析过夜，次日收集即为纯化后的TRAIL蛋白。

2.根据权利要求1所述的制备方法，所述的TRAIL蛋白具有24-26kDa左右的分子量。

3.根据权利要求1所述的制备方法，所述的诱导剂IPTG和硫酸锌的诱导浓度为0.8-1.2mmol/L。