[发明专利]重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的制备方法。 

背景技术

TRAIL是肿瘤坏死因子超家族新成员，表达于人类多种组织和细胞中，于1995年被Wiley等人[1]首次发现并克隆出来。人TRAIL基因位于染色体3q26，cDNA全长为1769bp，分子量为32.5KD，由281个氨基酸组成，功能部位为114位～281位氨基酸残基等电点7.6，属II型穿膜蛋白。TRAIL的活性部位在胞膜外的C末端并具有较强的保守性，其中第230位半胱氨酸(C230)对于维持其结构和生物活性具有重要作用。TRAIL可被体内的蛋白酶水解成游离的单体，3个TRAIL单体分子可通过C230螯合一个锌离子从而形成活性更强的三聚体。当C230突变时则不能形成三聚体，此时TRAIL与受体结合的能力降低，诱导肿瘤细胞凋亡的能力也降低。TRAIL能特异性与肿瘤细胞上的受体结合引起肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞几乎无影响，被认为是一种非常有发展前景的抗肿瘤制剂。常规的TRAIL蛋白的制备方法就是将制备好的重组质粒转化入大肠杆菌后37℃培养至OD为0.6加入IPTG后继续在37℃的条件下诱导蛋白表达。在此条件下也能诱导目的蛋白表达，但多为无生物活性的包涵体，即使有可溶性蛋白表达但产量很低其性质也不稳定极易变性。 

发明内容

本发明的目的是提供一种能够获得具有诱导肿瘤细胞凋亡的TRAIL蛋白的制备方法。为实现上述目的，本发明的技术方案如下： 

本发明一方面涉及一种重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的制备方法，其包括如下步骤：使用上游引物(5’-CG GGA TCC GTG AGA GAA AGA GGT C-3’)和下游引物(5’-CCC CCA GGT CAG TTA GC-3’)，以TRAIL全长cDNA序列为模板进行PCR扩增，PCR产物记为TRAIL_114-281； 

将TRAIL_114-281和载体pET-28a(+)使用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切回收后连接构建重组表达质粒pET-28a(+)-TRAIL_114-281，将其转化大肠杆菌E.coli DH5α中，通过酶切鉴定筛选出阳性转化子，将测序验证的重组质粒pET-28a(+)-TRAIL_114-281转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，培养后挑取单个菌落， 接种到含卡那霉素(Kan)的LB培养基中培养过夜；次日将过夜的菌液接种于LB中，加入的卡那霉素，36-38℃培养，当菌体密度OD值为0.5-0.7时，加入诱导剂IPTG和硫酸锌，24-26℃培养3-5h，取出菌液，离心收获湿菌； 

湿菌加入包含8-12％甘油，0.3-0.6mol/L NaCl，10-30mmol/L tris-Hcl，4-6mmol/L DTT，0.5-1.5mmol/L PMSF的缓冲溶液，超声裂解细菌，离心，收获上清，过滤除去杂质，加入咪唑使其终浓度为15-25mmol/L，采用亲和层析法镍柱纯化TRAIL蛋白，用400-600mmol/L咪唑溶液洗脱，收集洗脱液并置于PBS缓冲液中0-4℃透析过夜，次日收集即为纯化后的TRAIL蛋白。 

在本发明的一个优选实施方式中，所述的TRAIL蛋白具有24-26kDa左右的分子量。 

在本发明的另一个优选实施方式中，所述的诱导剂IPTG和硫酸锌的诱导浓度为0.8-1.2mmol/L。 

相比于现有技术，本发明的方法至少具有如下优势：诱导蛋白表达的温度由传统的37℃改为25℃，相比于37℃诱导表达的蛋白，在25℃低温条件下时使细菌生长速度减慢从而使目的蛋白表达的速度也减慢利于蛋白空间构像的折叠形成可溶性的具有生物活性的TRAIL蛋白；此外，在蛋白的诱导阶段加入1mM硫酸锌可以使TRAIL分子螯合入锌离子使其活性更强性质更稳定，而在细胞生长阶段就加入硫酸锌会影响细菌的生长从而影响蛋白的表达；其次，在纯化时重悬湿菌的缓冲液加入了DTT使TRAIL活性更强，并加入蛋白酶抑制剂PMSF可以防止TRAIL降解。 

附图说明