[发明专利]检测耳聋相关的线粒体T12201C突变试剂盒及应用

权利要求书

1.一种检测耳聋相关的线粒体DNA T12201C突变的试剂盒，由DNA提取混合液（1）、扩增T12201C片段的PCR混合液（2）、针对T12201C设计的一对外引物（3）、针对T12201C设计的内引物（4）、限制性内切酶（5）、阳性对照（6）、阴性对照（7）和盒体（8）组成，其中，DNA提取混合液（1）由细胞裂解液、蛋白酶K、氯仿、苯酚、无水酒精组成；扩增T12201C片段的PCR混合液（2）包括dNTP(脱氧单核苷酸)、10×PCR缓冲液、MgCl₂、三蒸水和Taq酶，针对T12201C设计的外引物（3）有外前向引物F: TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG (SEQ ID NO:1)，外反向引物R: AGA AGG ATA TAA TTC CTA CG (SEQ ID NO:2)；针对T12201C设计的内引物（4）包括内前向引物F: AATATAGTTTAACCAAAACATCAGATTGTGAATCTGACAACAGAGGCTTACGACCCAATA (SEQ ID NO:3)，内反向引物R: ATAGTAGTGTGCATGGTTATTAC (SEQ ID NO:4)；限制性内切酶（5）包括限制性内切酶SspⅠ；阳性对照（6）是不含有线粒体序列第12201位点发生T>C突变的酶切样本；阴性对照（7）是含有线粒体序列第12201位点发生T>C突变的酶切样本。

2.根据权利要求1所述的一种检测耳聋相关的线粒体DNA T12201C突变的试剂盒，其特征在于，在扩增T12201C片段的PCR混合液（2）中添加0.1-0.2μl二甲基亚砜。

3.根据权利要求1所述的一种检测耳聋相关的线粒体DNA T12201C突变的试剂盒在检测与耳聋相关的线粒体基因ND1T12201C突变中的应用，通过以下步骤实现：

（1）基因组DNA的提取：运用蛋白酶K消化裂解法，从样本中提取基因组DNA；

（2）特异性PCR扩增：使用Primer 5.0软件和Oligo7.0软件根据SEQ ID NO:5所示的人类线粒体基因序列所设计的引物F_外/R_外、F_内/R_内是能扩增出包含上述耳聋的线粒体突变位点的片段，F外/R外扩增出为线粒体DNA的核苷酸11929-12793，其序列为序列表中的SEQ ID NO:1、2；F内/R内扩增出为线粒体DNA的核苷酸12141-12356，其序列为序列表中的SEQ ID NO:3、4；

（3）酶切鉴定：将上述PCR产物用限制性内切酶Ssp Ⅰ对T12201C突变位点处进行酶切；

（4）突变检测：聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，直接根据酶切PCR产物产生的DNA片段数量及DNA片段大小，检测mtDNA是否发生T12201C突变。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述样本选用血标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）从样本中提取基因组DNA通过以下步骤实现：

（1）血标本：取20～200μl少量血标本或1cm²的血滤纸片放入1.5ml 离心管，加入900μl红细胞裂解缓冲液，20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH 7.6，室温静置10min，充分裂解红细胞，12000rpm离心1min，收集白细胞沉淀；

（2）带毛囊的毛发：用70%乙醇洗带毛囊的毛发1 次，后再用蒸馏水冲洗毛发2次，在1.5ml 离心管中分别放入2～4 根毛发，毛囊置于离心管底部，用干净的剪刀剪去毛发高于离心管的部分；

（3）口腔粘膜刮片或唾液：收集唾液前，必须让被收集者漱口，半小时内不要喝水、进食、吸烟，然后开始收集口腔粘膜刮片或唾液，选择如下方法收集唾液样本：①舌头围绕口腔刮取粘膜细胞，将约0.1ml唾液直接吐进离心管内；②生理盐水漱口，吐进离心管内，吸取PBS溶液至装有通过上述任一种方法收集的唾液样本的离心管中，反复吹打后，12000rpm离心5min，除去上清，重复该过程一次；③用棉拭子反复刮拭面颊内壁6次，空气中干燥，然后用灭菌过的镊子小心撕去其外表面，放入离心管中；④将唾液吐在滤纸上，空气中干燥后形成唾液斑，再用干净的剪刀剪成大小约1cm²碎纸片置于离心管中；

然后用细胞裂解液和蛋白酶K对上述样本进行消化裂解，利用盐析法去除蛋白等杂质，异丙醇沉淀DNA，最后用高压灭菌水溶解后于-20℃保存备用。