[发明专利]一种半定量河豚毒素检测卡的制作方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是指一种半定量河豚毒素检测试纸的制作方法。

背景技术

自上世纪90年代以来，我国共报道织纹螺中毒事件50起，中毒人数369人，死亡人数43，中毒死亡率11.2%，申请人所在的福建省在2009年与2010年都有因食用织纹螺而中毒死亡的事件发生。除织纹螺外，每年也都有发生河豚鱼中毒事件。

织纹螺与河豚鱼中所含有的毒素主要成份是河豚毒素及衍生物。

河豚毒素是一种非蛋白，低分子量的神经毒素，其可以与钠离子通道结合，进而影响到动物的肌肉与神经功能。河豚毒素最早是在河豚鱼中发现的，并在陆生及水生的生物中分布广泛，如在甲藻孢囊、钙性藻类、节肢动物、棘皮动物、软体动物、蠕虫、蝾螈以及青蛙中都有发现。

目前国内外对河豚毒素的检测主要为1）生物检测法，具体为小鼠检测法或组织培养检测法等，2）理化检测法，具体为荧光分析法、薄层层析法、高效液相色谱法或气相色谱法等；3）免疫学检测法，如直接竞争酶联免疫法等。

目前我们检测织纹螺毒素主要是应用小鼠检测法（DB35/531-2004《棕斑腹刺鲀、暗鳍腹刺鲀加工品》附录B河豚毒素检验），由小鼠法检测法直接测定毒性，对于水产品安全性检测是很重要的，尤其是对于未知的毒素和污染物，是难以替代的直观测定方法。但小鼠检测法的缺点是灵敏度不高，有假阳性现象，且重现性较差（标准偏差较大），无法断定毒素的成分，并对实验所用的小鼠的品系和体重要求苛刻。

理化检测法所需的样品前处理非常复杂。

目前，河豚毒素的仪器检测及小鼠检测都需要在实验室内由专业技术人员完成检测，并且成本昂贵，难以适应实际工作的需要。

为简单、方便的检测出水产品中有无河豚毒素的存在，专利CN202522562U提供了一种河豚毒素检测试纸，其是由载体板、硝酸纤维膜、胶体金垫、加样垫和吸收垫组成，载体板位于底层，硝酸纤维膜、胶体金垫、加样垫、吸收垫依次粘贴在载体板上表面，硝酸纤维膜位于载体板中部，胶体金垫设在硝酸纤维膜的一侧并与硝酸纤维膜部分重叠，加样垫设在胶体金垫上并与胶体金垫部分重叠，吸收垫设在硝酸纤维膜的另一侧并与硝酸纤维膜部分重叠，胶体金垫上均匀的涂布一层有胶体金标记的鼠抗河豚毒素单克隆抗体，硝酸纤维膜上靠近加样垫一端设有包被有检测抗原的检测线，靠近吸收垫一端设有包被有质控抗体的质控线。这种试纸虽然使用方便，但是它同时存在下列问题：1）对河豚毒素检测只是定性，没有定量，并且也没有给出检测限；2）试纸宽1cm，太宽，检测时浪费较多；3）使用纯化的单克隆抗体及高纯度的河豚毒素标准品制备人工抗原，抗体效价降低、成本高昂；4）金标抗体、人工抗原及羊抗鼠的使用量高，提高使用成本；5）层析试纸条设计不够合理，检测样品使用量较多，还需滴加生理盐水，检测方法不够简便；6）玻璃纤维膜切条后，再用胶体金标记的单克隆抗体涂布，37℃烘干，制备不方便，不适用于产业化生产。

发明内容

本发明提供了一种半定量河豚毒素检测卡的制作方法，其目的之一在于克服现有技术存在的仪器检测较为繁琐且太过专业化的缺陷以及现有的检测试纸只能定性检测的缺陷，并克服现有检测试纸使用纯化的单克隆抗体作为金标原料成本过高的缺陷。

本发明的技术方案如下：

一种半定量河豚毒素检测卡的制作方法，它包括以下步骤：

a、胶体金样品组合垫的制备：取河豚毒素人工抗原免疫过小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合培养，筛选阳性杂交瘤细胞体外培养，克隆扩大培养后冻存，选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡进行小鼠腹腔注射，6-8天后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，接着在5-12天后收集腹水，然后在pH7-pH11的环境下向腹水中加入10倍至50倍的胶体金标记溶液进行标记，接着将胶体金标记的腹水，用硫酸铵沉淀，胶体金缓冲液溶解后，用喷膜仪器喷到玻璃纤维膜上，真空干燥；

b、层析膜的加工：用划膜仪将形成检测线的河豚毒素人工抗原与形成质控线的质控抗体均匀地划在层析膜中间，干燥；

c、组装：将载体垫、所述层析膜、所述胶体金样品组合垫以及吸水垫拼接成层状结构，所述载体垫位于底部，其上方设有所述层析膜，所述胶体金样品组合垫和所述吸水垫分别设置于所述层析膜的两端，且所述胶体金样品组合垫和所述吸水垫分别与所述层析膜部分重叠，所述检测线设置在靠近所述胶体金样品组合垫的一端，所述质控线设置在靠近所述吸水垫的一端，用切条机将组装后的膜切割成条状结构，用卡式外壳进一步组装成检测卡。