[发明专利]病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.可特异性检测病毒性出血性败血症病毒的引物，其特征在于所述引物为：

VHSN-F：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

VHSN-F：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于设有盒体、操作说明书和检测试剂；操作说明书和检测试剂设在盒体内，所述检测试剂包括裂解液、吸附液、洗涤液、DEPC处理水、反转录反应液、VHSV-PCR反应液、阳性对照和阴性对照。

3.如权利要求2所述病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）制备盒体；

2）配制检测试剂：

裂解液为：5mol/L盐酸胍，0.1mol/L EDTA，去离子水定容至1L，pH为8.0；

吸附液为：将5g玻璃粉放在25～30mL水中悬浮，然后再加入等体积的硝酸反应，最后重新加水悬浮即可；

洗涤液为：0.1mol/L氯化钠，1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl，去离子水定容至1L，pH为7.5，再加入等体积的无水乙醇；

DEPC处理水：往超纯水中加入DEPC至终浓度为0.1%，振荡2h后，高温高压灭菌2次；

反转录反应液：每6μL反转录反应液含有1μL50mM VHSN-R引物；1μL dNTP混合物，每种dNTP浓度为10mM；2μL5×Primescript缓冲液；0.25μL RNase抑制剂；0.25μL逆转录酶，购自中国大连宝生物公司；0.3μL甘油；1.2μL DEPC处理水；

VHSV-PCR反应液：每18μL VHSV-PCR反应液含有1μL10mM VHSN-F引物；1μL10mMVHSN-F引物；1μL dNTP混合物，每种dNTP浓度为2.5mM；0.25μL Taq DNA聚合酶；2μL10×PCR缓冲液；1.5μL甘油；11.25μL双蒸水；

阴性对照：DEPC处理水；

阳性对照：将体外转录得到的VHSV核蛋白基因RNA片段稀释到10⁴拷贝/μL所得溶液；

3）将操作说明书、裂解液、吸附液、洗涤液、DEPC处理水、反转录反应液、VHSV-PCR反应液、阳性对照和阴性对照置入盒体内，即得病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂盒。

4.如权利要求3所述病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤2）中，所述阳性对照的制备方法如下：

（1）引物设计，具体方法为：

根据已获得的VHSV核蛋白基因序列，设计以下两条用于构建体外转录VHSV核蛋白基因RNA片段重组质粒pSP-VHSV的引物VHSV-long-F和VHSV-long-R，分别携带HindⅢ和BamHⅠ酶切位点：

VHSV-long-F：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

VHSV-long-R：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

（2）含有检测目的片段重组质粒pSP-VHSV的构建和作为阳性对照的RNA片段的制备，具体步骤为：

a）pSP-VHSV重组质粒的构建

使用VHSV-long-R作为反转录引物，将病毒RNA样品作为模板，经过反转录PCR反应，获得了目的片段，然后将获得的逆转录产物作为模板进行PCR扩增，将PCR产物回收后用HindⅢ和BamHⅠ内切酶做双酶切，再使用E.Z.N.A.^TM Cycle Pure试剂盒（OMEGA，USA）回收酶切产物，然后将酶切产物连接到pSP64poly(A)（Promega，USA）载体上，转化至感受态E.coliDH5α中，筛选阳性克隆并测序验证；

b）体外转录获得作为阳性对照的RNA片段

提取构建好的pSP-VHSV质粒，EcoRI线性化后回收质粒，再用Promega体外转录试剂盒体外转录获得小RNA片段，用1.2%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测RNA质量和浓度；根据RNA分子量确定单位体积RNA分子数，按10倍梯度稀释，分别稀释为1×10⁶到1×10¹拷贝/μL，获得浓度梯度的阳性RNA片段。

5.如权利要求3所述病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤2）中，所述硝酸的浓度为68%。