[发明专利]病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种RT-PCR检测试剂盒，尤其是涉及病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV)的RT-PCR检测试剂盒及其制备方法。

技术背景

病毒性出血性败血症(Viral hemorrhagic septicemia,VHS)是感染鲑类、鳟鱼、大菱鲆、鲈鱼、漠斑牙鲆、褐鳟、茴鱼等多种鱼类的一种致死性传染性疾病。该病导致鱼皮肤、肾脏和肝脏出血，死亡率约为90%。VHS的病原是病毒性出血性败血症病毒(VHSV)，属于弹状病毒科Novirhabdovirus属。VHSV基因组为一段单链负链RNA，其长度约12kp，线性基因组编码5个蛋白，包括：核衣壳蛋白(N蛋白)，两个结构蛋白(P和M蛋白)，糖蛋白(G蛋白)、RNA聚合酶(L蛋白)和一个非结构蛋白（NV蛋白），顺序为3’-Leader-N-P-M-G-NV-L-Trailer-5’。VHSV病毒粒子长约180nm，宽约70nm。在国际动物卫生组织和我国进境动物一、二类传染病名录中均被列为必报疫病。国际组织通常采用一些限制措施，从而避免染病鱼类流动到其他地区和国家,过去VHS主要流行于北美洲和欧洲一些国家。近年来,随着水生动物及其产品进出口贸易的急剧增加，VHSV已经传入我国，并在我国局部地区流行。

逆转录链式聚合酶反应（RT-PCR）是一种用于检测病毒和类病毒最常用的方法,已经应用到了一系列鱼病病毒的检测中，包括：昏睡病虹彩病毒(Sleeping disease virus)、大马哈鱼传染性贫血症病毒(Infectious salmon anaemia virus)、水生呼肠孤病毒属（Fish aquareovirus）、败血症病毒（Hemopoietic necrosis virus）。

病毒性出血性败血症病毒致死率非常高，给网箱养殖造成巨大的经济损失。防治病毒感染最有效的方式是防止接触病毒，有规律地进行常规检查，在鱼类运输前后，进行更严格的检测。原则上避免接触感染的养殖场，使用无病毒感染的饵料喂食，使用无病毒的养殖水体，使用经检测的鱼卵是控制VHSV的最有效措施。目前还没有一种有效的治疗方法，因此在感染初期检测病毒就显得非常重要。这就需要一种成本低、快速、特异性与灵敏度高的检测方法。在过去的几十年里，已经建立了几种检测病毒性出血性败血症病毒的方法。传统标准的检测方法是首先通过细胞培养分离出病毒，再使用特异方法如免疫荧光单抗（IFAT）或者抗体中和试验检测（[11]Fregeneda-GrandesJM,Olesen NJ.Detection of rainbow trout antibodies against viral haemorrhagicsepticaemia virus(VHSV)by neutralisation test is highly dependent on the virus isolate used.Dis Aquat Organ,2007,74(2):151-158）。我国2008年由国家质量监督检验检疫总局发布的国标GB/T15805.3-2008中，也采用了该方法。目前常用的还有酶联免疫吸附法（[12]Encinas P,Gomez-Casado E,Estepa A,Coll JM.An ELISA for detection of trout antibodies to viral haemorrhagic septicemia virus using recombinant fragments of their viral G protein.J Virol Methods,176(1-2):14-23）和实时定量RT-PCR（[13]Chico V,Gomez N,Estepa A,Perez L.Rapid detection and quantitation of viral hemorrhagic septicemia virus in experimentally challenged rainbow trout by real-time RT-PCR.J Virol Methods,2006,132(1-2):154-159）。但这些方法有的耗时长，有的要求使用昂贵的设备和试剂。RT-PCR技术是一种快速、特异性好和灵敏高的病毒检测方法，广泛的应用于饵料、养殖水体和环境监测中。以前也有关于VHSVRT-PCR检测方法的报道，但是只报道了特异性引物，没有形成试剂盒，操作时需要购买大量配套试剂，过程繁琐。

发明内容