[发明专利]一种手性N-保护哌啶醇的生物制备方法

权利要求书

1.一种手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，所述手性N-保护哌啶醇的结构式如下：

其中R代表保护基；

所述方法以N-保护哌啶酮为底物，使该底物在生物催化剂、辅因子及氢供体的存在下发生不对称还原反应生成手性N-保护哌啶醇，其特征在于：所述生物催化剂为重组酮还原酶，该酮还原酶的制备方法为：将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35～40℃下活化8～12小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35～40℃下振荡培养，培养至OD₆₀₀值达到0.6～0.8时，加入诱导剂，于25～33℃下继续培养8～12小时，离心，收集沉淀物，加入磷酸盐缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破碎8～12分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-10℃～-25℃，然后再冻干24～48小时，即得冻干粉状的重组酮还原酶；所述的氢供体为异丙醇，所述不对称还原反应在pH为7.0～9.0的水相缓冲液中、温度25℃～45℃下进行。

2.根据权利要求1所述的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，其特征在于：反应起始时的反应体系中，底物的浓度为3%～20%(w/v)，重组酮还原酶的用量为底物质量的2%～8%(w/w)，异丙醇的物质的量为底物的物质的量的1.5～6倍，辅因子的用量为底物质量的0.02%～1%(w/w)。

3.根据权利要求2所述的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，其特征在于：反应起始时的反应体系中，底物的浓度为4%～10%(w/v)，重组酮还原酶的用量为底物质量的4%～6%(w/w)，异丙醇的物质的量为底物的物质的量的4～6倍，辅因子的用量为底物质量的0.4%～0.6%(w/w)。

4.根据权利要求2或3所述的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，其特征在于：所述制备方法的实施过程如下：先将N-保护哌啶酮溶解在一部分异丙醇中，然后加入水相缓冲液，搅拌均匀后，加入重组酮还原酶与辅因子，维持在25℃～45℃，开始反应，同时开启充气泵向反应体系中鼓入空气，恒速流加剩余的异丙醇，HPLC监控，至反应转化率达到99.0%以上，终止反应。

5.根据权利要求4所述的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，其特征在于：反应终止后，向反应液中加入硅藻土搅拌，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，滤饼返回反应釜，加入乙酸乙酯搅拌过滤，合并有机相；有机相用饱和食盐水洗涤2～3次，浓缩后得到黄色油状物，加石油醚于黄色油状物中，于45～50℃下搅拌至均相，于-10℃～-20℃下静置，过滤后得到手性N-保护哌啶醇。

6.根据权利要求1所述的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，其特征在于：所述的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH。

7.根据权利要求1所述的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，其特征在于：所述的水相缓冲液为Tri-HCl缓冲液、TEA-HCl缓冲液或磷酸缓冲液。

8.根据权利要求1或7所述的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，其特征在于：所述的水相缓冲液的pH为7～7.5。

9.根据权利要求1至3中任一项权利要求所述的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，其特征在于：所述不对称还原反应的温度为28℃～32℃。

10.根据权利要求1所述的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，其特征在于：所述的手性N-保护哌啶醇的结构式如下：