[发明专利]一种手性N-保护哌啶醇的生物制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种手性N-保护哌啶醇的生物制备方法。

背景技术

大量具备重要生物活性的天然和非天然物质的结构中都包含有一个哌啶环。因此，在3-位上的碳原子衍生化之后形成的手性中心对于这些生物活性物质的性质有着非常重要的影响。在如何引入此手性中心的问题上，大量工作研究了还原3-位上的酮酯(J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1998,22,3673–3684,Acta Chem.Scand.1998,52,461–468.)。然而，对于并不含有酯结构的手性哌啶醇，特别是手性N-保护哌啶醇这类具有重要药物合成价值的化合物，对其如何合成却缺乏必要的研究。

(S)-N-Boc-3-羟基哌啶醇(结构式：)可以用于合成一种非天然药物抗充血性心力衰竭药卡莫瑞林(Bio.Med.Chem.2003,11,581–590)、BTK抑制剂ibrutinib、天然物质异白刺啉淋胺(isonitramine)和小果白刺碱(sibirine)等药物前体(Tetrahedron Lett.1989,30,2301–2304,J.Org.Chem.1984,49,1688–1691等)，因此该类化合物具有广泛的应用前景。

(S)-N-Boc-3-羟基哌啶醇可以由N-Boc-3-羟基哌啶酮制得，同时引入手性中心。传统的酮合成法有化学还原和生物还原。利用化学催化方法实现这一过程已有报道，但是由于效率较低，反应条件苛刻，产生的三废较多，没有能够实现工业化应用(US patent2011092698A1,WO2011036280A1)。

虽然利用生物转化实现还原反应生产手性仲醇已经成为成熟可靠的技术，但是通过文献检索，只有一个利用胡萝卜整细胞催化该还原反应的实例，所用催化剂较多(占底物质量的23.4%)，且来源不稳定。植物细胞反应涉及到品种、产地和季节，含有复杂的成分，对下游分离提取不利。更重要的是，该反应底物浓度较低(3.3mM)，产物光学纯度只有98%，不具备实际工业应用价值(Org.Lett.2009,11,1245–1248)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的手性N-保护哌啶醇的生物制备方法。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种手性N-保护哌啶醇的生物制备方法，所述手性N-保护哌啶醇的结构式如下：

其中R代表保护基；

所述方法以N-保护哌啶酮为底物，使该底物在生物催化剂、辅因子及氢供体的存在下发生不对称还原反应生成手性N-保护哌啶醇，其特征在于：所述生物催化剂为重组酮还原酶，该酮还原酶的制备方法为：将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35～40℃下活化8～12小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35～40℃下振荡培养，培养至OD₆₀₀值达到0.6～0.8时，加入诱导剂，于25～33℃下继续培养8～12小时，离心，收集沉淀物，加入磷酸盐缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破碎8～12分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-10℃～-25℃，然后再冻干24～48小时，即得冻干粉状的重组酮还原酶；所述的氢供体为异丙醇，所述不对称还原反应在pH为7.0～9.0的水相缓冲液中、温度25℃～45℃下进行。

根据本发明的进一步实施方案：反应起始时的反应体系中，底物的浓度为3%～20%(w/v)，重组酮还原酶的用量为底物质量的2%～8%(w/w)，异丙醇的物质的量为底物的物质的量的1.5～6倍，辅因子的用量为底物质量的0.02%～1%(w/w)。进一步优选地，反应起始时的反应体系中，底物的浓度为4%～10%(w/v)，重组酮还原酶的用量为底物质量的4%～6%(w/w)，异丙醇的物质的量为底物的物质的量的4～6倍，辅因子的用量为底物质量的0.4%～0.6%(w/w)。

根据一个具体方面，所述制备方法的实施过程如下：先将N-保护哌啶酮溶解在一部分异丙醇中，然后加入水相缓冲液，搅拌均匀后，加入重组酮还原酶与辅因子，维持在25℃～45℃，开始反应，同时开启充气泵向反应体系中鼓入空气，恒速流加剩余的异丙醇，HPLC监控，至反应转化率达到99.0%以上，终止反应。