[发明专利]干细胞样肺癌细胞制备及其抗原组合物负载树突状细胞的方法与试剂盒

权利要求书

1.一种制备干细胞样肺癌细胞的方法，其特征在于，所述方法包括鉴定待测肺癌细胞标本中是否存在干细胞样肺癌细胞的步骤：

所述步骤包括检测所述待测肺癌细胞标本中是否特异表达以下差异蛋白的至少两种：蛋白激酶C iota、五次跨膜单链糖蛋白Prominin1、乙醛脱氢酶1或乳腺癌耐药蛋白ATP结合转运蛋白G超家族成员2。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述特异表达差异蛋白是指使用蛋白免疫印迹技术检测所述肺癌细胞标本中的所述差异蛋白的结果为阳性；

其中，以已知纯肺癌细胞为阴性对照，用蛋白免疫印迹技术检测100份所述阴性对照，每份含5×10⁶个细胞，测得每种差异蛋白的灰度与标准内参β肌动蛋白的灰度比值，将所测该种差异蛋白灰度比值的平均值与标准方差之和定义为分界值；

取100份待测肺癌细胞标本，每份标本含5×10⁶个细胞，测得与阴性对照所测同种差异蛋白灰度比值的平均值，该灰度比值的平均值大于等于所述分界值，即该待测肺癌细胞标本的该种差异蛋白的蛋白免疫印迹技术检测结果为阳性。

3.根据权利要求1或2所述的方法，当鉴定所述待测肺癌细胞标本中存在干细胞样肺癌细胞时，该方法还包括：

使用免疫磁珠法和/或流式细胞仪分选法富集所述待测细胞中的干细胞样肺癌细胞的步骤；

其中，利用针对得到特异表达的蛋白激酶C iota、五次跨膜单链糖蛋白Prominin1、乙醛脱氢酶1或乳腺癌耐药蛋白ATP结合转运蛋白G超家族成员2中以上差异蛋白的至少两种的抗体。

4.一种干细胞样肺癌细胞抗原组合物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)按照权利要求1-3中任意一项所述的方法制备干细胞样肺癌细胞，

2)用生理盐水洗涤并重悬所述干细胞样肺癌细胞，

3)裂解所述干细胞样肺癌细胞；

其中，所述步骤3)包括通过热休克和/或反复冻融来裂解干细胞样肺癌细胞；所述热休克裂解的条件包括在37～45℃下保持1h-6h；所述反复冻融的次数为3-5次的间隔时间是10min-2h，所述冷冻的温度范围是零下120℃-零下196℃，所述融化的温度范围是20℃-37℃。

5.一种干细胞样肺癌细胞抗原负载的树突状细胞的制备方法，其特征在于，该方法包括：通过裂解干细胞样肺癌细胞得到干细胞样肺癌细胞抗原组合物，将正常树突状细胞与干细胞样肺癌细胞抗原组合物接触得到负载肿瘤抗原的抗肺癌树突状细胞，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-3中任意一项所述的方法制备干细胞样肺癌细胞，或者使用权利要求4中任意一项所述的方法制备干细胞样肺癌细胞抗原组合物。

6.一种由权利要求5所述的方法得到的干细胞样肺癌细胞抗原负载的树突状细胞。

7.一种树突状细胞疫苗，所述树突状细胞疫苗包括树突状细胞，其特征在于，所述树突状细胞为权利要求6所述的干细胞样肺癌细胞抗原负载的树突状细胞。

8.一种制备干细胞样肺癌细胞抗原负载的树突状细胞疫苗的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)干细胞样肺癌细胞基础培养基；

2)蛋白激酶C iota、五次跨膜单链糖蛋白Prominin1、乙醛脱氢酶1或乳腺癌耐药蛋白ATP结合转运蛋白G超家族成员2的至少两种；

3)消化细胞的酶；

4)B27或N2、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素；

5)树突状细胞基础培养基；

6)巨粒细胞-噬细胞集落刺激因子；

7)白介素-4、干扰素α和肿瘤坏死因子α；以及

6)使用说明书；

其中，所述使用说明书包括权利要求5所述的方法。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括针对所述蛋白激酶C iota、五次跨膜单链糖蛋白Prominin1、乙醛脱氢酶1或乳腺癌耐药蛋白ATP结合转运蛋白G超家族成员2的至少两种的抗体。

10.一种干细胞样肺癌细胞裂解抗原组合物负载的DC疫苗的制备方法，其特征在于，用眼科剪将肺癌瘤组织剪碎成为约1mm³的小块；所得剪碎的组织小块用0.25％胰酶溶液以1克：0.5mL的重量体积比消化5分钟后，加入胰酶溶液体积1/5的小牛血清终止，以1000rpm离心收集消化好的组织小块，弃上清，所得离心沉淀用阿尤替斯酶以1克：1mL的体积比在37℃下混匀消化10分钟，然后在1000rpm下离心5min收集细胞，用以1克：1mL的重量体积比用杜尔贝可改良伊格尔-F12培养基重悬；所得重悬液用40μm分子筛过滤；用所述孔径的分子筛过滤，截留的是大片细胞碎片和未被消化的细胞团，滤出的是细胞悬液；

收集所述细胞悬液，并向其中含有5ng/mL B27、40ng/mL人表皮生长因子、30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和30mg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔-F12培养基使细胞悬液浓度被稀释为2×10⁶细胞/mL；然后将每5mL所得稀释的细胞悬液转移至25cm²灭菌塑料培养瓶中在37℃、5％CO₂培养箱中培养24h；

培养所得细胞呈成神经球状悬浮生长，吸取培养基到15mL离心管中，每分钟1000转，4℃离心10分钟收集悬浮细胞，弃上清，沉淀细胞添加新鲜的含有8ng/mL B27、30ng/mL人表皮生长因子、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20mg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔-F12培养基；当细胞球生长达到1μm左右时，用Accutase消化成单细胞后，用含有8ng/mL B27、30ng/mL人表皮生长因子、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20mg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔-F12培养基进行传代培养；按照上述传代条件再传4代，得到成神经球状的细胞；

使用成神经球培养得到10⁸个细胞的干细胞样肺癌细胞，用0.5mL孵育液PBE充分混匀细胞，加入一抗，4℃孵育30分钟；其中，所述的孵育液PBE为含0.5％BSA和0.08％EDTA的pH7.21×PBS，真空抽滤除菌及液体内气体；所述的一抗为20μg/ml终浓度的兔抗人PKC iota抗体；

用20倍体积PBE洗细胞一次，再加0.3mL PBE充分混匀细胞后，加入50μL二抗山羊抗兔IgG(H+L)包被的超微磁珠，混匀后置8℃孵育15分钟，然后加入5倍体积PBE洗细胞3次，再用0.3mL PBE充分混悬细胞；

将分离柱安装入磁铁分离器中，加入0.5ml PBE，在重力作用下自然流尽，预处理分离柱；向分离柱中加入0.3mL细胞的PBE悬液，在重力作用下自然流尽PBE；将分离柱从磁铁分离器上取下，用注射器吸取冲洗液加压注入，洗脱下吸附的PKC iota阳性细胞；

使用一抗为小鼠抗人PROM1、兔抗人ALDH1和小鼠抗人ABCG2的抗体，以及相对应的二抗山羊抗鼠和山羊抗兔的IgG(H+L)包被的超微磁珠，可连续分选出表达PKC iota、PROM1、ALDH1和ABCG2中至少两种的干细胞样肺癌细胞；

使用上述传代培养获得10⁸个细胞，用1×PBS重悬至2×10⁶/mL，加入20μg/mL终浓度的兔抗人PKC iota抗体，在37℃下孵育90分钟，并间隔10分钟摇匀一次；然后细胞用冷的1×PBS洗涤一次，并4℃下每分钟1000转离心5分钟收集细胞，加入5mL含50μL FITC标记的二抗山羊抗兔IgG(H+L)的冷的1×PBS，混匀后置4℃孵育30分钟，并用冷的1×PBS洗涤3次，重悬于5mL的1×PBS中；细胞悬液然后使用流式细胞仪FACSVantage SE分选，根据仪器使用说明书操作分选获得PKC iota阳性细胞；

使用一抗为小鼠抗人PROM1、兔抗人ALDH1和小鼠抗人ABCG2的抗体，以及相对应的FITC标记的二抗山羊抗鼠和山羊抗兔的IgG(H+L)，使用流式细胞仪FACSVantage SE连续富集表达PKC iota、PROM1、ALDH1和ABCG2中至少两种的的干细胞样肺癌细胞；

或先使用磁珠法富集PKC iota阳性细胞，然后使用流式细胞仪富集其他差异蛋白阳性的细胞，这样也能获得富集特异表达两种以上差异蛋白的干细胞样肺癌细胞；

取上述所得富集特异表达PKC iota、PROM1、ALDH1和ABCG2中至少两种的干细胞样肺癌细胞，选择富集PKC iota和PROM1双阳性，PKC iota、PROM1和ALDH1三阳性，PKC iota、PROM1、ALDH1和ABCG2四阳性的干细胞样肺癌细胞；在液氮中和室温25℃下反复冻融5次，通过倒置显微镜检测到所述细胞完全裂解；所得裂解液在600rpm下离心1min，收集上清用0.45μm滤膜过滤，收集滤液；所述裂解液即干细胞样肺癌细胞的抗原组合物，储存在-80℃中备用；

取100mL外周血经Ficoll-Hypaque密度梯度离心，得到单个核细胞；外周血单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，并加入6孔板中贴壁；在37℃、5％CO₂培养箱中孵育90min后，未贴壁细胞洗涤收集下来，用于诱导CIK细胞；贴壁细胞加入完全培养基RPMI1640诱导培养，含有5％的自体血清、2000IU/mL重组人粒细胞巨噬集落刺激因子和1500IU/mL IL-4；在培养到第三天时细胞更换新鲜培养基；培养到第五天收获未成熟树突状细胞DCs，成熟DCs采用完全RPMI1640培养基在诱导到第七天得到，含0.1μg/mL脂多糖和20ng/mL肿瘤坏死因子α；在第五天时添加特殊抗原，负载DCs；其中，所述的新鲜培养基含2000IU/mL GM-CSF和1500IU/mL IL-4；特殊抗原为PKC iota、PROM1、ALDH1和ABCG2四阳性干细胞样肺癌细胞抗原；

培养5天后，3×10⁶个未成熟DCs用上述制备的干细胞样肺癌细胞裂解抗原组合物在37℃、5％CO₂培养箱中负载4小时；抗原负载的DCs通过离心收获得到；所得DCs经生理盐水洗涤3次，后重悬到生理盐水中，至浓度为3×10⁶成熟DC/mL，并添加终浓度为质量体积比2％的人血白蛋白，从而制备成干细胞样肺癌细胞裂解抗原组合物负载的DC疫苗。