[发明专利]高纯度替考拉宁的分离纯化法

权利要求书

1. 高纯度替考拉宁的分离纯化法，其特征在于，其包括如下步骤:

1） 将替考拉宁发酵液用微滤膜除去发酵液中固含，收集滤液；

2） 含替考拉宁的滤液通过纳滤膜浓缩，得到替考拉宁浓缩液；

3） 替考拉宁浓缩液再经过两次大孔树脂吸附、洗脱后，得到高纯度的替考拉宁洗脱液；

4） 最后将洗脱液纳滤浓缩，往浓缩液中加入蛋白质沉淀剂，使浓缩液蛋白质沉淀，过滤除去蛋白质，得到滤液；

5） 往滤液中加入活性炭脱色，过滤得到脱色液；

6） 最后往脱色液中加入丙酮后，低温结晶，晶体经真空干燥后，获得高纯度的替考拉宁成品。

2. 根据权利要求1 所述的高纯度替考拉宁分离纯化方法，其特征在于步骤（1）所述微滤膜孔径为0.1μm。

3. 根据权利要求1 所述的高纯度替考拉宁分离纯化方法，其特征在于步骤（2）所述纳滤膜截留分子量为700～800Da。

4. 根据权利要求1所述的高纯度替考拉宁分离纯化方法，其特征在于步骤（4）所述蛋白质沉淀剂为丙酮，且直至丙酮体积为浓缩液体积的60%。

5. 根据权利要求1所述的高纯度替考拉宁分离纯化方法，其特征在于步骤（5）所述滤液活性炭脱色，活性炭添加量为0.9～1.3%（w/v）的量加入，搅拌脱色30min。

6.根据权利要求1所述的高纯度替考拉宁分离纯化方法，其特征在于步骤（6）所述的结晶溶剂为丙酮，其体积是脱色液体积的3倍；所述的低温是4℃，结晶时间12h，所述真空干燥的温度是30℃，时间是12h。

7.根据权利要求1所述的高纯度替考拉宁分离纯化方法，其特征在于步骤（3）大孔树脂洗脱所采用的洗脱剂是丙酮、异丙醇或乙腈水溶液；

第一、二次洗脱采用的洗脱剂的pH值分别为4.5，9.5，其中第一次树脂吸附采用含pH4.5磷酸盐缓冲液的溶剂清洗、洗脱，第二次树脂吸附采用pH9.5溶剂清洗、洗脱获得高纯的的洗脱组分；

洗脱方法是采用低浓度的洗脱溶剂清洗以去除树脂上吸附的杂质和色素，中等浓度的洗脱溶剂对树脂吸附替考拉宁产物进行洗脱；所述的低浓度对于丙酮、异丙醇和乙腈水溶液浓度分别为15～20%、15%～25%和16%～23%;所述的中等浓度的洗脱溶剂对于丙酮、异丙醇和乙腈浓度分别为28～30%、22%～30%和30%～35%。

8.根据权利要求7所述的高纯度替考拉宁分离纯化方法，其特征在于第一、二次洗脱采用的洗脱剂的，分别是含pH4.5磷酸盐缓冲液、pH9.5溶剂。