[发明专利]高纯度替考拉宁的分离纯化法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种高纯度替考拉宁分离纯化方法，属于抗生素分离纯化技术领域。

背景技术

    替考拉宁(Teicoplanin)为替考游动放线菌发酵产生的一组糖肽类抗生素，是继国际公认的抗耐药菌抗生素万古霉素后开发的另一种抗耐药菌糖肽类抗生素，主要对革兰氏阳性需氧和厌氧菌具有较强的抗菌活性，特别对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）引起的感染有很好的疗效，是目前临床上为数不多的仍具有对多重耐药性金黄色葡萄球菌和肠球菌有抗菌活性的药物之一。

    替考拉宁是5个化学结构十分相似化合物Teicoplanin A2（TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5）和去酰基葡糖胺Teicoplanin A3 ( T-A3) 组成的混合物，其中TA2-2为主要有效成分多种成分组成的混合物。结构复杂，对热、酸、碱稳定性差，生产过程中容易引起失活和分解，且发酵液中替考拉宁的含量较低，目前采用的分离纯化过程较复杂。替考拉宁主要的提取方法有：溶媒萃取法、吸附法、离子交换法和色谱法。溶媒萃取法由于溶剂使用量大，分离纯化效果差，制备的最终产品纯度低，所以目前该法已经很少采用。离子交换法，由于使用酸性离子交换树脂会增加T-A2 糖基部分的降解，强碱性离子交换树脂却易增加T-A2 的差向异构化，且离子交换树脂因选择性较差也不能有效地用于纯化T- A2，因此该法的应用前景不被看好。色谱法，由于使用的色谱填料昂贵，生产成本高，不利于工业化运用。吸附法采用的主要介质为大孔吸附树脂、活性炭等，其原料易得、价格低廉，替考拉宁纯化效果好，已成为替考拉宁提取的主要方法。

发明内容

    本发明提供了一种高纯度替考拉宁的分离纯化法，采用吸附法结合膜分离、结晶等方法，成本低，替考拉宁分离纯度高，适宜商业化大生产。

一种高纯度替考拉宁的分离纯化法，其特征在于步骤如下:

（1）将替考拉宁发酵液用微滤膜除去发酵液中固含，得到含替考拉宁的微滤液； 微滤膜可除去发酵液中菌丝体、培养基等固含物质；微滤膜孔径为0.1μm；微滤膜材质为无机陶瓷膜；

（2）滤液通过截留分子量为700～800Da纳滤膜浓缩，得到替考拉宁浓缩液；

    通过纳滤膜能减少微滤液中的水分，浓缩替考拉宁产物，减少后续树脂吸附上样的时间；

（3）替考拉宁浓缩液再经过两次树脂吸附洗脱后，得到高纯度的替考拉宁洗脱液；

所述的树脂均为大孔吸附树脂，其中包括AMBERLITE XAD 1180N、AMBERLITE XAD 7HP、DIAION HP20、上海华震HZ801和HZ816等；

所述的洗脱剂可以是丙酮、异丙醇或乙腈水溶液；

洗脱方法是采用低浓度的洗脱溶剂清洗以去除树脂上吸附的杂质和色素，中等浓度的洗脱溶剂对树脂吸附替考拉宁产物进行洗脱；其中,低浓度清洗丙酮、异丙醇和乙腈水溶液浓度分别为15～20%、15%～22%和16%～23%;中等浓度的洗脱溶剂丙酮、异丙醇和乙腈浓度分别为28～30%、25%～34%和30%～35%；

所述的洗脱剂pH为4.5或9.5，其中第一次树脂吸附采用含pH4.5磷酸盐缓冲液的溶剂清洗、洗脱，第二次树脂吸附采用pH9.5溶剂清洗、洗脱获得高纯的的洗脱组分；

（4）最后将洗脱液纳滤浓缩，采用蛋白质沉淀方法，使浓缩液的蛋白质沉淀，过滤除去蛋白质，得到滤液；

所述的蛋白质沉淀剂方法是将丙酮添加到浓缩液直到丙酮量达到60%（v/v）；在此条件下蛋白质从溶液中析出沉淀而替考拉宁产物仍然保留在溶液中，从而可通过过滤方式除去蛋白质；

（5）往滤液中加入活性炭脱色，过滤得到脱色液；

活性炭按照0.9～1.3%（w/v）的量加入，搅拌脱色30min；

（6）脱色液中添加丙酮后低温结晶，晶体经真空干燥后，获得纯度大于96%的高纯度的替考拉宁成品。       

     丙酮的体积是脱色液体积的3倍，结晶温度为4℃，结晶时间12h；真空的温度是30℃，时间是12h。

附图说明

图1是实施例1所分离的替考拉宁成品的液相色谱图。

具体实施方式

    以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

    实施例1