[发明专利]一种葡萄霜霉病菌的快速分子检测方法与应用

说明书

(一)技术领域

本发明“一种葡萄霜霉病菌的快速分子检测方法与应用”，本发明属于作物病害诊断与防治技术领域，具体涉及一种葡萄霜霉菌的分子检测方法及应用。

(二)背景技术

葡萄(Vitis vinifera)是世界上栽培面积最大、产量最多的果树之一，已经具有5000～7000年的栽培历史，世界葡萄产业的贸易额超过581亿美元(2010年度葡萄产业技术发展报告)，远远超过其他果树。葡萄作为一种世界性的水果，具有多种价值，随着人民生活水平的提高，无公害葡萄及葡萄产品的需求量逐渐增加，葡萄产业向着优质、绿色、健康的方向发展是大势所趋。葡萄霜霉病一直是制约葡萄和葡萄酒产业的一大瓶颈，一般年份可减产10～20％，严重的可达70～80％，并且严重影响次年的产量和品质，目前该病的最主要防治手段仍是喷施化学农药，但随着施药量的增加，出现了如果实品质下降、环境污染、病菌抗性产生等一系列问题。及时、准确预测霜霉病的发生时期、流行强度，确定药剂使用时期、次数和剂量能够提高药效、减少施药次数、降低生产成本、减轻环境污染等因农药使用所带来的负面影响，为霜霉病的综合防治提供依据。因此，开展葡萄霜霉病预测预报研究对于科学防治葡萄霜霉病具有重要的意义。目前，还没有葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)快速检测技术的报道，因此，建立高效、快速的早期检测技术将为葡萄霜霉病的科学防控提供新的思路，推动葡萄产业的健康发展。

传统的霜霉早期检测方法往往根据病组织的症状、病原菌的特征以及研究人员的经验进行，但是，霜霉菌引起的早期褪绿与其他病原引起的症状相似，很难准确判断。另一方面，霜霉菌是专性寄生菌，不能进行人工培养，因此不能单靠传统的分离培养、血清鉴定和ELISA等方法进行检测难度较大，霜霉目真菌的检测方法为葡萄霜霉病菌的检测提供了很好的借鉴。

霜霉目真菌的检测方法主要有菌体化学染色法、荧光检测法、酶联免疫吸附法、特异性聚合酶链式反应等手段。近年来，酸性品红、苯胺蓝、棉兰藏红等染色剂都被用于对玉米组织中大孢指疫霉(Sclerospora macropsora)菌丝体的检测。周肇慧等提出了棉兰一藏花红染色法能有效地检出向日葵种子中的霜霉菌，崔铁军等在对向日葵种子带菌规律的研究过程中，也发现了霜霉菌的自体荧光现象，并据此建立了向日葵霜霉病种子带苗的荧光检验法，结果显示：在荧光显微镜的视野内，寄主组织不发生荧光或只具微弱的黄色荧光，霜霉菌菌丝和吸器发出亮蓝色荧光，形态和结构清晰可见。向日葵种子中潜藏的其它种带病菌(主要为半知菌)菌丝不发出荧光或荧光极弱，很容易与霜霉菌区分。但当病菌在寄主组织中仅以菌丝体的形态存在时，染色法只能准确地判断病菌是否为卵菌，仍缺乏分类上种的鉴定能力。

合适的分子靶标是开发病原菌分子检测技术的基础，目前大多数植物病原菌的分子检测靶标都是基于ITS序列。Valsesia等基于葡萄叶片霜霉菌(P.viticola)的ITS序列的定量实时荧光PCR的高通量检测方法，检测灵敏度可达0.1pg。刘艳等建立了基于大豆霜霉菌(Peronospora man-schurica)的rDNA ITS序列的早期检测方法，灵敏度可以达到0.1pg。同时为了快速准确的检测土壤中辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)，王淑芳等建立了基于辣椒疫霉病菌ITS序列的实时荧光定量检测体系，利用构建的标准曲线和优化的实时荧光定量体系对人工接种含梯度浓度的辣椒疫霉菌的土壤样品进行实时荧光定量PCR检测，效果良好。孟军等就三种在农业生产上危害比较严重的疫霉菌P.nicotianae、P.infestans、P.sojae和首次在我国报道的疫霉种P.tentaculata的分子检测靶标进行了研究，采用普通PCR、套式PCR等技术对以上四种疫霉菌的游动孢子、卵孢子、发病植株、病田的土壤样品进行分子检测，结果显示：普通PCR检测灵敏度均为100pg，套式PCR对游动孢子和厚垣孢子的检测精度可达1～3个游动孢子和1个卵孢子，该体系可用于田间土壤和发病植物组织中的P.nicotianae、P.infestans和P.tentaculata进行快速灵敏的检测。但是，由于ITS存在着无法区分一些病原菌与其亲缘种的缺点，因此开发出更精确的病原菌检测方法势在必行。