[发明专利]一种阿伦膦酸功能化的聚乙二醇修饰的纳米颗粒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及非病毒基因传递系统领域，具体涉及一种阿伦膦酸功能化的聚乙二醇修饰的纳米颗粒及其制备方法。

背景技术

基因治疗为一些重大疾病提供了一种很有发展前途的治疗方法。自从1990年基因治疗临床试验开始，目前仅有一两个基因治疗药物被批准上市，其主要的原因是因为缺乏稳定的基因表达，和安全、高效的基因投递载体。

磷酸钙是一种优良的非病毒基因载体，具有良好的组织相容性和吸收性。常见的磷酸钙-基因共沉淀方法制得的颗粒粒径大于100nm且难于控制，稳定性差，难于用于体内转染。

公开号为101829330A的中国专利申请公开了一种载有治疗基因的磷酸钙复合纳米粒，其中质粒包裹到磷酸钙纳米粒中，形成包裹质粒DNA的磷酸钙“复合纳米粒”并用于骨髓间质干细胞的传递。但该载有基因的磷酸钙复合纳米粒未经化学修饰，若用于体内转染易与血液中带正电或负电的蛋白质或其它大分子结合而失效，或被内皮质网系统吞噬。

Leaf Huang等利用反相微乳法制备磷酸钙-siRNA纳米颗粒（LCPII），然后再磷酸钙纳米颗粒表面覆盖一层脂质体，并进一步用连接靶向配体的PEG修饰脂质体表面。该系统在体内取得了较好的效果[J.Control.Release142(2010)416-421,Molecular Therapy vol.20no.3,609–615mar.2012]。但该LCPII系统的制备方法中操作步骤多，影响转染效率的因素多，同时使用的阳离子脂质体具有较高的细胞毒性，且磷脂材料价格昂贵，不利于将来的临床应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明旨在提供一种适用于体内转染的阿伦膦酸功能化的聚乙二醇修饰的纳米颗粒及其制备方法。该阿伦膦酸功能化的聚乙二醇修饰的纳米颗粒粒径小，多阿伦膦酸-聚乙二醇能够稳固的覆盖在磷酸盐-基因颗粒表面，从而有效且长时间稳定纳米颗粒，延长体内循环的时间，低成本，低毒，安全有效。

第一方面，本发明提供了一种阿伦膦酸功能化的聚乙二醇修饰的纳米颗粒，所述阿伦膦酸功能化的聚乙二醇修饰的纳米颗粒为包裹有目标投递物的磷酸钙颗粒或碳酸钙颗粒，所述磷酸钙颗粒或碳酸钙颗粒表面覆盖有阿伦膦酸功能化的聚乙二醇，所述目标投递物选自DNA、siRNA、蛋白质类大分子药物或小分子化学药物，所述阿伦膦酸功能化的聚乙二醇修饰的纳米颗粒粒径为20～50nm，所述阿伦膦酸功能化的聚乙二醇的化学结构式为：

优选地，所述阿伦膦酸功能化的聚乙二醇修饰的纳米颗粒粒径为20～30nm。

第二方面，本发明提供了一种阿伦膦酸功能化的聚乙二醇修饰的纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备阿伦膦酸功能化的聚乙二醇

取分子量为600～12000道尔顿的化合物A，溶解于有机溶剂四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环、氯仿或二氯甲烷中，得到含有化合物A的溶液；

化合物A：

取pH值为7.0～8.0的谷氨酸溶液，按所述谷氨酸和所述化合物A的摩尔比为4.0：1～1.5:1的比例加入所述含有化合物A的溶液中，室温反应8～12h，然后调节混合溶液pH值至2.5～4.5，萃取，取有机相干燥、减压浓缩以及随后在搅拌下滴加至冷乙醚中，静置，收集沉淀，干燥得化合物B1；

化合物B1：

取所述化合物B1溶解于有机溶剂四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环、氯仿或二氯甲烷中，加入N-羟基丁二酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，于-30～0℃温度下搅拌0.5～1h，室温下反应12～24h，过滤，弃沉淀，制得含有化合物C1的溶液，所述化合物B1的羧基、N-羟基丁二酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1.05～1.2:1.05～1.2；

化合物C1：

取pH值为7.0～8.0的阿伦膦酸溶液，按所述阿伦膦酸的氨基和所述化合物B1的羧基的摩尔比为4.0：1～1.5:1的比例加入所述含有化合物C1的溶液中，室温反应8～12h，然后调节混合溶液pH值至2.5～4.5，萃取，取有机相干燥、减压浓缩以及随后在搅拌下滴加至冷乙醚中，静置，收集沉淀，干燥得化合物D1，所述化合物D1为阿伦膦酸功能化的聚乙二醇；

化合物D1：