[发明专利]一种霉菌融合子用于添加中药制曲的方法

权利要求书

1.一种霉菌融合子的构建及其用于添加到中药制曲的方法，其特征在于依次包括以下工艺步骤：

（1）菌丝体的培养及预处理

将两亲本白曲霉与绿色木霉分别转接于培养基上，待其生长30~48小时后，用无菌水制成10⁷~10⁹个/ml霉菌孢子菌悬液；在无菌条件下将300μL霉菌孢子菌悬液接种于液体培养基中，于温度30~32℃，转数100~120rpm的气浴摇床中振荡培养18~24小时，得菌丝球培养液；将菌丝球培养液经无菌擦镜纸抽滤、无菌水漂洗去除培养基；再用0.9mol/L的氯化钠渗稳剂在离心机中离心洗涤3次，每次5分钟，即得预处理后的湿菌丝体；

（2）原生质体的制备

①将步骤（1）预处理后的湿菌丝体称取0.5g置于50ml实验瓶中，白曲霉按0.5~1.0g/10ml的量加入复合酶液，于温度30~32℃、转数80~100rpm恒温气浴条件下进行酶解，酶解2~3小时后用无菌擦镜纸过滤，滤液于2500~3000rpm离心10分钟，之后用渗稳剂离心洗涤3次，每次5分钟，收集白曲霉原生质体并悬于渗稳剂溶液中，得白曲霉原生质体悬浮液；

②将步骤（1）预处理后的湿菌丝体称取0.5g置于50ml实验瓶中，绿色木霉按1.0~1.5g/10ml的量加入复合酶液，于温度30~35℃、转数80~100rpm恒温气浴条件下进行酶解，酶解3~5小时后用无菌擦镜纸过滤，滤液于2500~3000rpm离心10分钟，之后用渗稳剂离心洗涤3次，每次5分钟，收集绿色木霉原生质体并悬于渗稳剂溶液中，得绿色木霉原生质体悬浮液；

（3）原生质体非对称灭活：

①白曲霉热灭活

取步骤（2）中①白曲霉原生质体悬浮液1ml于EP管中，在60~65℃恒温水浴中灭活20~30分钟，然后立即放入冰浴中完全冷却；

②绿色木霉紫外灭活

取步骤（2）中②绿色木霉原生质体悬浮液5ml置于带磁力搅拌子的培养皿中，将培养皿置于磁力搅拌台上，于紫外灯下照射；

（4）融合子构建：

将两亲本灭活后的原生质体悬浮液在离心管中等量混合，然后加入配比为30~50%的聚乙二醇，0.01mol/L的氯化钙和0.7~0.9mol/L氯化钠融合剂，混匀后放入恒温培养箱中于30~32℃培养30~40分钟，取出融合后原生质体悬浮液放入冷冻离心机中，用渗稳剂离心洗涤3次，每次5分钟；将洗涤完成的原生质体重悬于0.7~0.9mol/L的氯化钠渗稳剂中，得到融合后的原生质体；

（5）融合子的筛选：

①融合子初筛

将融合完成后的悬浮液稀释后涂布于淀粉再生平板中，于30~32℃培养1~3天，中间每隔12小时观察一次，挑选出透明圈大的融合子菌株用平板划线分离法纯化，再将分离纯化后的融合子菌株接种于羧甲基纤维素钠培养基上，于30~32℃培养2~3天，挑选出能够生长的融合子；

②融合子复筛

挑选多株上述初筛的融合子接种于羧甲基纤维素钠液体培养基上，其中羧甲基纤维素钠用淀粉取代，无菌条件下于30~32℃培养2~3天后加入碘液，挑选出淀粉利用情况好的融合子，再将其接入无机盐液体培养基中，加入无菌滤纸条，于30~32℃培养5~8天，再挑选出既能利用淀粉又能降解滤纸条的融合子，进行传代培养；

（6）融合子用于添加中药制曲：

将步骤（5）中得到传代稳定的融合子进行扩大培养，再制成浓度为10⁷~10⁸个/ml的融合子孢子悬浮液；制曲所用中药粉碎后过40目筛子；制曲大米经除杂、淘洗后蒸煮40分钟，将其摊凉后接入2~3%（v/w）融合子孢子悬浮液和添加量为0.5~1%（w/w）的中药粉，在无菌条件下使中药粉和融合子孢子悬浮液均匀分布于蒸米中；将蒸米堆积并加盖八层纱布，在温度36~38℃、湿度90~95%的条件下培养36~48小时，期间每隔12小时翻曲一次，再在温度30~32℃、湿度90~95%条件下堆积培养24~36小时，培养完成后将中药曲摊平，在温度40℃、湿度50%条件下干燥15小时，即制得融合子中药曲。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述白曲霉中加入的复合酶液为纤维素酶:蜗牛酶按7:3的比例混合溶于0.02mol/L 磷酸盐缓冲液中，配制成复合酶液，其浓度为10mg/ml；以0.45μm滤膜过滤除菌后置于4℃冰箱中备用。