[发明专利]一种霉菌融合子用于添加中药制曲的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药制曲技术，特别涉及一种霉菌融合子用于添加到中药制曲的方法；该方法是利用非对称灭活技术构建霉菌融合子并将其用于添加到中药制曲中，得到同时具有糖化酶活力、纤维素酶活力和中药活性成分的药曲，属于轻工生物技术领域。

背景技术

药曲是酿造等行业的糖化发酵剂，传统药曲的制作方法类似于传统酿酒大曲或酿酒小曲的生产方法。药曲中的微生物来源于自然接种或原有曲粉传种，通过微生物的自然发酵对制曲原料的原有特性会产生一定程度的转化，而制备成的一类传统中药或药食两用的曲药产品[中药发酵的概况与关键技术. 中国药业. 2008，15(17)： 15-17.]，但是，通过微生物育种技术获得高性能纯种药曲未见报道。

常用的微生物育种技术主要有自然分离、诱变筛选、细胞结合、原生质体融合、基因导入以及基因破坏等方法。原生质体融合方法是指通过人为因素使遗传性状不同的两个细胞的原生质体融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。对原生质体的融合技术，传统方法多采用抗药性标记或营养缺陷标记亲本菌株，以便检出融合子菌株，其工作相当繁琐且工作量大[以抗生素抗性为选择标记的毛壳菌种间原生质体融合.华东理工大学学报（自然科学版）.2010，36（1）：36-41.]。因此，如能提供一种工艺更简单、操作方便且易于实现霉菌融合子构建、并能将其用于添加到中药制曲的方法中，这正是本发明的任务所在。

发明内容

本发明的目的正是为了克服现有技术中所存在的缺陷和不足，而提供一种霉菌融合子用于添加中药制曲的方法，该方法是利用非对称灭活技术构建霉菌融合子，再将该霉菌融合子用于添加到中药制曲中，获得同时具有糖化酶活力、纤维素酶活力和中药活性成分的、且具有一定保健功能因子的融合子中药曲。

本发明的基本思路是采用非对称灭活技术，根据“致死损伤互补”原则，非对称灭活使原生质体的部分细胞器特异性损伤，单独培养不能再生，只有损伤部分发生互补修复才能再生，这就减少了工作量。采用非对称灭活原生质体融合技术构建霉菌融合子，并将该霉菌融合子添加到中药制曲中，制备成同时具有糖化酶活力、纤维素酶活力和中药活性成分的中药曲。该中药曲对酿造过程中增强产品保健等功能、提高酿酒原材料中纤维质利用率具有重大意义。

为实现上述目的，本发明采用由以下技术措施构成的技术方案来实现的。

本发明提供的一种霉菌融合子用于添加中药制曲的方法，依次包括以下工艺步骤：

（1）菌丝体的培养及预处理

将两亲本白曲霉（ZZH）与绿色木霉（TV）分别转接于培养基上，待其生长30~48小时后，用无菌水制成10⁷~10⁹个/ml霉菌孢子菌悬液；在无菌条件下将300μL霉菌孢子菌悬液接种于液体培养基中，置于温度30~32℃，转数为100~120rpm的气浴摇床中振荡培养18~24小时，得菌丝球培养液；将菌丝球培养液经无菌擦镜纸抽滤、无菌水漂洗去除培养基；再用0.9mol/L的氯化钠渗稳剂在4℃离心机中离心洗涤3次，每次5分钟，即获得预处理后的湿菌丝体；

（2）原生质体的制备

①将步骤（1）预处理后的湿菌丝体称取0.5g置于50ml实验瓶中，白曲霉按0.5~1.0g/10ml的量加入复合酶液，于温度30~32℃、转数80~100rpm恒温气浴条件下进行酶解，酶解2~3小时后用无菌擦镜纸过滤，滤液于2500~3000rpm离心10分钟，之后用渗稳剂离心洗涤3次，每次5分钟，收集白曲霉（ZZH）原生质体并悬于渗稳剂溶液中，得白曲霉原生质体悬浮液；

②将步骤（1）预处理后的湿菌丝体称取0.5g置于50ml实验瓶中，绿色木霉按1.0~1.5g/10ml的量加入复合酶液，于温度30~35℃、转数80~100rpm恒温气浴条件下进行酶解，酶解3~5小时后用无菌擦镜纸过滤，滤液于2500~3000rpm离心10分钟，之后用渗稳剂离心洗涤3次，每次5分钟，收集绿色木霉（TV）原生质体并悬于渗稳剂溶液中，得绿色木霉原生质体悬浮液；

（3）原生质体非对称灭活：

①白曲霉（ZZH）热灭活

取步骤（2）中①白曲霉原生质体悬浮液1ml于EP管中，在60~65℃恒温水浴中灭活20~30分钟，然后立即放入冰浴中完全冷却；

②绿色木霉（TV）紫外灭活

取步骤（2）中②绿色木霉原生质体悬浮液5ml置于带磁力搅拌子的培养皿中，将培养皿置于磁力搅拌台上，于紫外灯下照射；

（4）融合子构建：