[发明专利]一种抗人组织因子单链抗体及其制备方法

权利要求书

1.一种抗人组织因子单链抗体，其特征是采用逆转录聚合酶链式反应技术，从中国专利CN 200910227865.0中制备的抗组织因子杂交瘤细胞株出发，扩增获得抗体的轻链可变区基因VL和重链可变区基因VH，然后用一段连接序列Linker连接而成的单链抗体，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

2.如权利要求1所述的抗人组织因子单链抗体，其特征是所述的单链抗体基因含有354个核苷酸组成的重链可变区基因VH，其序列为SEQ ID NO:2。

3.如权利要求1所述的抗人组织因子单链抗体，其特征是所述的单链抗体基因含有321个核苷酸组成的轻链可变区基因VL，其序列为SEQ ID NO:3。

4.如权利要求1或2所述的抗人组织因子单链抗体，其特征是所述的抗体重链可变区基因VH编码 118个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

5.如权利要求1或3所述的抗人组织因子单链抗体，其特征是所述的抗体轻链可变区基因VL编码 107个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

6.如权利要求1所述一种抗人组织因子单链抗体，其特征是所述的单链抗体与TF₂₄₃保持高特异性结合，作为一种肿瘤治疗的抗体物质。

7.如权利要求1所述抗人组织因子单链抗体的制备方法，其特征是：

（1）抗人组织因子单链抗体的基因克隆

利用CN200910227865.0制备的抗人组织因子单克隆抗体杂交瘤细胞株，TRIZOLLS试剂提取细胞总RNA；RT-PCR方法分别以VL-F/VL-R和VH-F/VH-R扩增鼠源抗人组织因子单抗的轻链可变区VL、重链可变区VH基因片段；合成双链Llinker，对应的编码核苷酸序列为：GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG；以上步获得的VH、VL 和双链Linker为模板，VH-F、VL-R为引物，扩增VH-Linker-VL 基因片段，并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定；

PCR扩增引物序列如下：     

VH-F： GCCATGGCCATGGAGATCCAGCTGCAGCAGTCTG（含NcoI和保护碱基） 

VH-R： TGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACTGTGAGAG

VL-F： GGCGGTGGCGGATCGGACATTCAGATGACCCA

VL-R： GGATCCTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAG（含BamHI）

Linker-F：CTCTCACAGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGC

GGTGGCGGATCG

Linker-R：TGGGTCATCTGAATGTCCGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGA

ACCGCCTCCACC

（2）抗人组织因子单链抗体原核可溶表达载体的构建

选择phoA-6his质粒（由山西省生物研究所保存）作为表达载体，该质粒通过碱性磷酸酶启动子及信号序列将外源蛋白表达至细胞周质间；NcoⅠ和BamHⅠ双酶切phoA-6his质粒和VH-Linker-VL PCR产物用后，连接，转化至E.coli DH5α，氨苄青霉素筛选阳性克隆，酶切鉴定，测序分析；

（3）抗人组织因子单链抗体在MM294细菌中表达及纯化 

重组表达载体转化MM294大肠杆菌，LB培养基摇菌后稀释菌至低磷酸盐（0.1mmol/L）诱导培养基中培养；培养24 h后，离心收集菌体；菌体与蛋白提取缓冲液按1：5比例混匀，高压匀浆破碎，低温高速离心，收集上清；采用Ni sepharose^TM 6 Fast Flow亲和层析纯化；纯化样经SDS-PAGE凝胶电泳分析； 

（4）抗人组织因子单链抗体的活性鉴定

以中国专利CN200510012414.7制备的截断型人重组组织因子TF₂₄₃为抗原，利用非竞争ELISA法测定抗组织因子单链抗体蛋白与TF₂₄₃的结合特异性：选取96孔酶标板， pH9.6碳酸盐缓冲液包被TF₂₄₃，4℃保存过夜后明胶封闭；甩干后依次加入单链抗体蛋白、HRP酶标二抗、邻苯二胺(OPD)，492 nm处酶标仪测定。