[发明专利]一种抗人组织因子单链抗体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程抗体领域，具体涉及一种抗人组织因子单链抗体的制备及其应用。

背景技术

组织因子(tissue factor, TF)为一个跨膜糖蛋白，是引起凝血反应的起始蛋白质，能激活和启动外源凝血途径，在生理性止血中起着重要作用。近年来的研究发现，组织因子不仅在凝血途径中起着重要作用，在各种恶性肿瘤中也常常异常表达。临床研究表明，多种肿瘤细胞都不同程度地过度表达TF，且TF的表达与肿瘤细胞的转移能力呈高度正相关。TF通过形成TF/VIIa复合物，激活或上调细胞因子IL-8 、CCN1、VEGF 等的表达从而影响肿瘤的侵袭和转移。因此，研究阻断或调节TF活性的途径，特异性地抑制病态组织中的TF，是当前该领域研究的热点。

单克隆抗体具有高效、低毒和靶向性强的特点，在恶性肿瘤的治疗中越来越受到人们的关注。以组织因子作为新的靶蛋白，利用组织因子抗体的靶向性和抗原抗体的特异性，抑制TF活性，阻断细胞信号传导途径，从而减弱肿瘤细胞的生长和转移，是目前探索治疗肿瘤的重要策略之一。已有文献报道，组织因子鼠源性单克隆抗体经动物实验证明，对黑色素瘤、肺癌等有较好的疗效，特别是对造血系统肿瘤如白血病、非霍奇金淋巴瘤等疗效更好。Huang(Science,1997, 275(5229):547-550.)和Versteeg (Mol Med,2004,10(16):6.)等的动物模型研究也证明：TF抗体与TF结合后，可以靶向性抑制肿瘤血管的生成，导致肿瘤坏死。但鼠源单克隆抗体具有较强的免疫原性，容易产生人抗鼠抗体（HAMA）放应而降低疗效；而人源性抗体制备尚存在许多技术障碍，为其临床应用带来了困难。单链抗体（single chain variable fragment, scFv）是将抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL通过连接肽（Linker）重组而成的一种小分子基因工程抗体，它在保持原有抗体良好的抗原结合能力的同时，具有分子量低，穿透力强，体内循环半衰期短以及免疫原性低等优势，可通过特异性结合肿瘤表面的TF应用于癌症治疗。同时单链抗体还可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异性抗体的基础元件。

发明内容

本发明目的是克服上述已有技术的不足，提供一种分子量小、对肿瘤组织穿透力强、免疫原性低的抗人组织因子（TF）单链抗体（scFv）及其制备方法。

本发明是采用逆转录聚合酶链式反应技术，从中国专利CN 200910227865.0中制备的抗组织因子杂交瘤细胞株出发，扩增获得抗体的轻链可变区基因VL和重链可变区基因VH，然后用一段连接序列Linker连接而成的单链抗体，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

所述的单链抗体基因含有354个核苷酸组成的重链可变区基因VH，其序列为SEQ ID NO:2。所述的抗体重链可变区基因VH编码 118个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

所述的单链抗体基因含有321个核苷酸组成的轻链可变区基因VL，其序列为SEQ ID NO:3。所述的抗体轻链可变区基因VL编码 107个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

本发明抗人组织因子单链抗体的制备方法，其步骤如下：

（1）抗人组织因子单链抗体的基因克隆

利用CN200910227865.0制备的抗人组织因子单克隆抗体杂交瘤细胞株，TRIZOLLS试剂提取细胞总RNA。RT-PCR方法分别以VL-F/VL-R和VH-F/VH-R扩增鼠源抗人组织因子单抗的轻、重链可变区基因片段VL和VH；合成双链Linker，对应的编码核苷酸序列为：GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG。以上步获得的VH、VL 和双链Linker为模板，VH-F、VL-R为引物，扩增VH-Linker-VL 基因片段，并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定；

PCR扩增引物序列如下：     

VH-F： GCCATGGCCATGGAGATCCAGCTGCAGCAGTCTG（含NcoI和保护碱基） 

VH-R： TGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACTGTGAGAG

VL-F： GGCGGTGGCGGATCGGACATTCAGATGACCCA

VL-R： GGATCCTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAG（含BamHI）