[发明专利]一种重组人转化生长因子TGFB3的制备方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种重组人转化生长因子TGFB3的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

皮肤组织损伤后的创面组织修复是医学中最古老的课题之一，这个复杂的正常病理生理过程至今其机制仍不完全清楚，主要过程包括：炎症反应、肉芽组织形成、伤口收缩及再塑。疤痕指皮肤从真皮乳头层到深部发生损伤后，缺失部位以结缔组织置换。结合临床和病理学特征，疤痕通常可以分为三类：1.瘢痕疙瘩，其形态如蟹爪状，具有向四周浸润性生长的特点；2.增生性瘢痕，又称肥厚性疤痕，隆起高出于皮面；3.扁平疤痕，平坦，不高于皮面。一般文献中常把前两种称之为异常疤痕，而第三种为正常瘢痕。

由于创伤、运动伤、手术切口等多种原因，导致皮肤外伤机会多，疤痕的发生率也很高。异常瘢痕局部隆起、发红、瘙痒，并常有继发挛缩畸形，造成容貌的毁损和身体机能障碍，给患者带来不便与痛苦。据《柳叶刀》杂志统计，每年全球有2亿3千万手术量，可见疤痕的潜在威胁十分巨大。在临床上，强调创面早期各种前瞻性防范措施的应用，以及疤痕形成前后的综合性治疗，但目前临床可选用药物极其匮乏，对异常疤痕的治疗缺乏有效的手段和方法。

增生性疤痕是创伤及外科手术后常见的皮肤等组织的后遗症，一般认为，在创面愈合过程中，细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的过渡产生或(和)沉积是疤痕形成的主要成因，同时ECM的过渡沉积也是疤痕的重要病理学特征和疤痕增生发展的主要物质基础。目前研究证明，多种细胞因子参与了创面愈合过程中ECM的产生和沉积，而转化生长因子(Transforming Growth Factor Beta，TGF-Beta)就是创面愈合过程中与疤痕形成最为密切，也是最具有代表意义的细胞因子。

转化生长因子B(transforming growth factor13，TGFB)是一组结构相关、功能相似的多功能活性多肽。到目前为止，研究人员在脊椎动物中已发现5种TGF-B蛋白，即TGF Beta1～Beta5，而哺乳动物中仅发现3种：TGF Beta1-Beta3。

现有研究结果证实，TGF-Beta3在胚胎无瘢愈合中起非常重要的作用。在创面愈合过程中，TGF-Beta1、TGF-Beta2有促进ECM沉积导致疤痕形成的作用，而TGF-Beta3则具有促进创面愈合和减少疤痕形成的双重生物学作用。国外学者已开始通过动物创伤模型探讨应用外源性TGF-Beta3来减少创面肉芽组织过渡生长及再塑阶段的疤痕形成，并得到令人鼓舞的结果。

TGF-Beta s是一种具有多重生物学作用的多肽蛋白分子，在哺乳类中主要有TGF-Beta1、TGF-Beta2、TGF-Beta3三种异构体。现有研究结果证实，TGF-Beta3在胚胎无瘢愈合中起非常重要的作用。在创面愈合过程中，TGF-Beta1、TGF-Beta2有促进ECM沉积导致疤痕形成的作用，而TGF-Beta3则具有促进创面愈合和减少疤痕形成的双重生物学作用。国外学者已开始通过动物创伤模型探讨应用外源性TGF-Beta3来减少创面肉芽组织过渡生长及再塑阶段的疤痕形成，并得到令人鼓舞的结果。

TGF-B3主要以间充质起源的细胞产生为主，分子量为12.5KDa，可通过真原核细胞表达，其主要的生物学功能主要包括：诱导如成纤维细胞等的间质细胞等的间质细胞增生和分化；促进细胞外基质(ECM)的形成、加快伤口愈合；抑制包括上皮细胞、内皮细胞及淋巴细胞等的增殖与分化；抑制免疫反应、防止肿瘤的发生和恶变等方面。鉴于此，TGF-B3现已成为细胞因子家族药物中研发的热点之一，已有研究报告利用原核和真核表达系统来表达TGFB3蛋白。利用真核表达系统表达rhTGFB3量低，操作复杂，成本高，并不利于工业化生产；而大肠杆菌表达rhTGFB3蛋白时以包涵体形式存在，因其复杂的二硫键配对导致的分离纯化和复性问题，故难以获取活性蛋白。

发明内容：

本发明在已构建rhTGF.B3原核表达质粒并成功表达rhTGF-B3的基础上，旨在建立一条rhTGF-B3纯化、复性和生物学活性测定的工艺流程，为rhTGF-B3蛋白的大规模生产提供了一种经济可行的方法，解决现有技术分离纯化复姓困难的缺陷，提供一种高活性的TGFB3.

本发明提供一种纯化重组TGF-B3的方法，该方法是由如下步骤组成，具体为：包涵体的收集和洗涤；包涵体的溶解；变性蛋白的纯化；单体蛋白的复性；复性蛋白的纯化；

具体实施方式：

实施例1：

1.包涵体的收集与洗涤