[发明专利]使用生物标志物检测化合物诱导DNA链间交联损伤的方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地说，本发明涉及Erbb2基因作为效应标志物在检测化学物质诱导DNA链间交联损伤的应用。

背景技术

DNA链间交联损伤是癌症等重大疾病发生的重要原因之一。导致DNA链间交联损伤的因素有很多，如体内代谢过程中产生的自由基和其它活泼中间体，环境中的紫外线和离子辐射，一些内源和外源化学物质等。其中，亲电烷化剂作为一类重要的化学物质在细胞体内可以分解成活泼的离子，这些离子能够与一条DNA链上的碱基发生烷化反应形成活泼中间体，进而与另一DNA链发生烷化反应，最终在细胞中形成DNA链间交联。DNA链间交联能阻止DNA链的分离，完全阻断DNA的复制或转录，若不能及时被修复，DNA链间交联的最终结果是细胞死亡。多种致癌物质和临床应用的抗癌药物都能够导致DNA链间交联损伤。环境中、食品中广泛存在的亚硝胺类化合物经过代谢活化后均能够生成烷基正离子与DNA碱基发生反应，导致DNA链间交联损伤并最终诱发癌症。临床上常用的烷化剂类抗癌药物也是通过导致癌细胞DNA链间交联损伤而发挥抗癌作用，如用于治疗脑瘤、白血病等的亚硝基脲类烷化剂、用于治疗恶性淋巴瘤等的氮芥类烷化剂等。

DNA链间交联损伤作为癌症发病和癌症疗效的一种重要的分子标志物，其检测分析癌症防治、癌症治疗、分子生物学等领域研究的热点。目前，检测DNA链间交联损伤的检测方法主要有凝胶电泳法、荧光光谱检测法、碱洗脱法、单细胞凝胶电泳法和色谱质谱法等方法。Su等人（S.Su,et al.Chem.Biol.Interact.,2006,162(1):81～87）借助凝胶电泳方法证明GRP58蛋白和丝裂霉素C导致的DNA链间交联的形成有关。Ueda-Kawamitsu等人（H.

Ueda-Kawamitsu,et al.Biochem.Pharmacol.,2002,63:1209～1218.）采用溴化乙锭荧光法检测L1210细胞中由BCNU引起的DNA链间交联情况并分析交联物生成的代谢动力学和药效学，结果显示DNA链间交联在药物处理后第6小时达到最大值。赵修南等人（赵修南等.解放军药学学报,2004,20(6):421-424）应用微孔滤膜碱洗脱技术检测顺铂诱发小鼠淋巴细胞白血病L1210亲本细胞株和耐顺铂细胞株DNA链间交联效应，结果证明耐顺铂细胞株耐药的主要原因是DNA链间交联降低了。Wen Y等人（Y.Wen,et al.Mutat Res.2011,716(1-2):84～91）利用单细胞凝胶电泳技术检测双环氧丁烷诱导的DNA链间交联和DNA-蛋白质交联情况，结果显示双环氧丁烷诱导的DNA损伤主要是DNA链间交联损伤。Bodell等人（W.J.Bodell,et al.J.Neurooncl.,2009,91:257～264）报道了利用高效液相色谱-质谱联用技术检测氯乙基亚硝基脲烷基化产物，该方法检测到包括DNA链间交联产物在内的13种DNA烷化损伤产物。

综上所述，现有技术中报道的DNA链间交联损伤检测方法虽然被广泛应用于致癌物和抗癌物的毒理、药理研究中，但各自存在以下不足之处：

1.凝胶电泳方法实验步骤比较简便，但是定量效果较差：根据条带强度可以比较交联程度，但是无法得到更为明确的数量关系，因此电泳往往用于对DNA交联的简单定性分析；

2.荧光光谱检测法与碱洗脱法需要特殊的荧光染料，易受样品杂质干扰，实验结果重现性低，不能确定烷化位点，实验过程不易于操作；

3.单细胞凝胶电泳法检测DNA链间交联损伤，需要有断裂剂的加入，易受外界因素干扰，实验结果重现性差；

4.色谱质谱法检测DNA链间交联损伤，样品需要经过脱盐、浓缩等复杂的前处理过程，而且质谱仪器价格昂贵、操作复杂、对分析环境要求高，实验成本高。

因此，DNA链间交联损伤需要一种改进的方法，用于简便、快速、可靠地确定致癌物和抗癌药物诱导的DNA链间交联损伤情况。

发明内容

本发明的目标是提供一个与DNA链间交联损伤特异性相关的生物标志物Erbb2基因，并提供利用Erbb2基因检测化学物质诱导的DNA链间交联损伤的方法。

所述Erbb2基因（Gene ID：13866，Official Symbol：Erbb2，Genebank登录号：NM_001003817）是一种原癌基因，所编码的Erbb2蛋白是185kDa的细胞膜受体，为表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)家族成员之一。