[发明专利]鹰嘴豆壳二孢叶枯病环介导等温扩增快速检测方法

权利要求书

1.一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病环介导等温扩增快速检测方法，其特征在于按下列步骤进行：

a、待检样品或真菌的DNA提取：

采用常规真菌DNA提取方法提取待检样品核酸，其中提取样品DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.6-2.0，浓度为10-100ng/μL；

b、进行鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌的环介导等温扩增反应：

在装有22μL环介导等温扩增反应液的反应管中加入2μL待检样品模板DNA和1μL Bst DNA聚合酶，于恒温65℃扩增反应30-60min，将温度调到80℃终止反应，3-5min后取出待检；

c、显色检测：在每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，即为待检样品中含有或为鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中环介导等温扩增反应液是由10×Thermopol反应缓冲液、1.0-1.4mmol/L脱氧核酸三磷酸基质、4-8mmol/L硫酸镁、0.8-1.6μmol/L上游内引物FIP、0.8-1.6μmol/L下游内引物BIP、0.2-0.3μmol/L上游外引物F3、0.2-0.3μmol/L下游外引物B3、0.2-0.8μmol/L上游环引物LF和0.2-0.8μmol/L下游环引物LB组成，其中：

上游外引物F3：5’-CTTGGTATTCCATGGGGCAT-3’；

下游外引物B3：5’-ACTTTTGGACGTCGTCGTTAT-3’；

上游内引物FIP：5’-GAGGCGAGACAAACACCCAACA-GCCTGTTCGAGCGTCATT-3’；

下游外引物BIP：5’-CGCCTTAAAACAATTGGCAGCCG-GAGTGCAAAGCGCGAGAT-3’；

上游环引物LF：5’-CCAAGCAAAGCTTGAAGGTACA-3’；

下游环引物LB：5’-GCGTATTGATTTCGGAGCGCAGT-3’。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b环介导等温扩增反应液中10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b环介导等温扩增反应液中的脱氧核酸三磷酸基质由dUTP、dATP、dGTP和dCTP四种脱氧核糖核酸组成，其中四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中Bst DNA聚合酶为8U/μL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c中显色剂为10％的荧光染料SYBR GREEN I。