[发明专利]鹰嘴豆壳二孢叶枯病环介导等温扩增快速检测方法

说明书

技术领域

本发明设涉及一种利用环介导等温扩增技术进行菌样的快速检测的方法，具体是一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei的环介导等温扩增快速检测方法。

背景技术

鹰嘴豆壳二孢叶枯病由鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei引起，是一种毁灭性的病害。1911年，鹰嘴豆壳二孢叶枯病在巴基斯坦被首次发现，该病害的危害性很高，在鹰嘴豆的重要种植区巴基斯坦，年受害面积高达25-50％。冷凉的气候非常适合病害发展，常造成100％的产量损失。2007年，该病害在新疆北部的鹰嘴豆主栽区昌吉州木垒县、奇台县等地暴发，其中仅在木垒县发病面积为4000hm²，平均为害株率46％，严重田块为害株率达到100％，产量损失率为40％-50％。该病害主要危害叶片、叶柄、茎杆，也可侵染幼嫩的荚果。叶片被害后由叶缘向内扩散，形成“U”形或“V”形浅褐色至深褐色病斑，潮湿时病斑上产生分散的细小黑点，叶柄和茎杆受害初期产生水浸状病斑，随后病斑逐渐变为深褐色，病斑处凹陷并逐渐萎蔫干枯造成落叶断枝，严重时整株枯萎死亡。豆荚受害初期产生水浸状病斑，然后变成深褐色病斑，严重时豆荚干枯。雨水偏多年份，发病严重，产量损失极大。因此，开展鹰嘴豆壳二孢叶枯病菌检测，防止其从发病区向未发病区传播，以及在其发病初期进行诊断检测，对鹰嘴豆壳二孢叶枯病的传播与控制具有重要意义。

自从发现鹰嘴豆壳二孢叶枯病以来，各国研究人员便对其检测技术进行研究。传统的检测方法是从病残体或带病种子分离菌体，将其接种在相应培养基上，于适宜温度培养数天，再对这些菌体的形态进行观察。若产孢则继续观察分生孢子的形态特征，从菌落上挑片镜检，观察菌丝、分生孢子、分生孢子梗等形态。从而确定是否存在鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定是否由Ascochyta rabiei引起的病害。传统的检测方法不仅操作繁琐、费时，而且要求有高度的专业知识，尤其不能满足病害防治中快速诊断及海关进出境快速检测和鉴定的需求。

基因芯片技术虽然能够同时进行多种真菌的鉴定，但成本高，制约了其发展；杂交方式固有的局限性影响了其特异性；质谱技术以其快速真确的优点被用于微生物鉴定，由于质谱鉴定必须是培养后分纯的单克隆菌落，而且设备昂贵，操作难度高，因此，限制了其应用。

近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，出现了多种核酸扩增方法，如链替代扩增反应(Strand Displacement Amplification，SDA)，滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)，以及目前被广泛使用的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)等。这些扩增方法都有其启动新一轮核酸合成的创新之处。

其中，基于rDNA-ITS的长度多态性和序列多态性的序列分析，由于可以从不太长的核酸序列中获得相对足够的信息用来反应生物亲缘关系与分类情况，因而成为真菌分类及鉴定研究的热点，目前已广泛应用于真菌的属种间及种内组群水平的系统学研究。因此，应用PCR技术对病原菌进行特异、灵敏快速分子检测的成功例子已越来越多。国内外有学者利用基于ITS碱基序列设计引物对真菌的分子检测开展研究，但PCR方法需要昂贵的PCR仪，对设备要求较高，不适宜在基层进行推广。