[发明专利]一种水产品中蓝藻毒素β-甲氨基-L-丙氨酸含量的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及水产品中污染物的检测方法，更具体涉及一种水产品中蓝藻毒素β-甲氨基-L-丙氨酸（BMAA）含量的检测方法。

背景技术

当今世界范围内的蓝藻水华发生频率和规模均呈上升趋势，多个国家的内陆湖泊和近岸海洋水体均处于严重富营养化状态，因此开展对于蓝藻水华污染物的研究及其对人类健康风险评价已刻不容缓。目前研究的重点在微囊藻毒素（Microcystin）等传统污染物上，对于其他蓝藻毒素研究很少，而大多数蓝藻均能产β-甲氨基-L-丙氨酸BMAA毒素的现象自从2003年被发现之后，引起了国际社会的高度重视，多个地区均已开展了检测研究。目前国外的研究已经表明即使在不存苏铁的海洋水环境中，两种形态存在的BMAA（游离态和结合态）仍然可以通过水生生物食物链（蓝藻-浮游植物-浮游动物-鱼）进行迁移和放大。该成果暗示在我国水华暴发水域或蓝藻大规模生长水域也可能存在类似的毒素迁移和放大途径。我国是世界上蓝藻水华暴发最严重区域之一，开展内陆湖泊天然水环境中蓝藻BMAA毒素的调查分布研究显得尤为重要。

由于目前缺乏防止藻类水华发生的有效措施，因此要预防和消除蓝藻毒素对人畜的危害，监测和控制蓝藻毒素在各类水产品中的限量是行之有效的方法。液相色谱质谱联用法已经被应用于水体和生物体中多种藻毒素化合物的检测。然而对于BMAA的检测研究较少。现有BMAA通常采用荧光HPLC方法来检测，灵敏度不高、检测结果不准确。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种灵敏度高、检测结果准确的水产品中蓝藻毒素β-甲氨基-L-丙氨酸含量的检测方法。

技术方案：本发明提供的一种水产品中蓝藻毒素β-甲氨基-L-丙氨酸含量的检测方法，包括以下步骤：

（1）预处理：将冷冻干燥的水产品粉碎均匀，加入三氯乙酸水溶液于冰浴上匀浆，离心，得上清液；沉淀加入盐酸溶液水解后，滤膜过滤，得滤液；合并上清液和滤液，55℃氮吹浓缩，得浓缩液；

（2）衍生化：将浓缩液加入盐酸溶解，取20μL衍生化，得待测液；

（3）液相色谱-四级杆-电喷雾质谱分析：采用液相色谱-四级杆-电喷雾质谱检测步骤（2）的待测液，β-甲氨基-L-丙氨酸以保留时间和特征离子确定，绘制标准曲线，以外标法定量检测，色谱-质谱条件分别为：

液相色谱条件：仪器型号：Agilent1290/6460HPLC/MS/MS；液相色谱柱：EclipseXDB-C18柱，4.6×100mm×5.0μm，柱温为45℃；流动相为A：0.1%氨水，B为28%乙腈水；流速为0.60mL/min；

质谱条件：电喷雾离子源：正离子电离模式ESI+；干燥气温度320℃离子源温度；气体流速10Lmin^-1；气压40psi；毛细管电压3500V；鞘气温度320℃；鞘气流速11Lmin^-1；喷嘴电压1000V；选择多反应监测模式（MRM）。

步骤（1）中，步骤（1）中，水产品与三氯乙酸水溶液的用量比为（10-20）mg：2ml，优选15mg：2ml；三氯乙酸水溶液的浓度为0.05-0.2mol L^-1，优选0.1mol L^-1；匀浆采用超声匀浆，超声波功率为600-800W，超声时间5-15min，优选10min；离心转速为8000-12000r/m，优选12000r/m，离心时间为6-15min，优选10min；盐酸溶液的浓度为3-10molL^-1，优选6molL^-1；水解温度为110℃，水解时间为18h-24h，优选24h；滤膜孔径0.22μm或0.45μm，优选为0.22μm；浓缩方法采用于45℃-70℃下氮吹浓缩，优选55℃下氮吹浓缩。

步骤（2）中，盐酸溶液的浓度为10mmolL^-1-20mmolL^-1，优选20mmolL^-1；衍生化方法为AccQ-TagΜLtra Derivatization Kit(Waters,USA)试剂盒说明书方法。

有益效果：本发明提供的水产品中蓝藻毒素β-甲氨基-L-丙氨酸含量的检测方法操作简单、分析速度快，该方法针对水环境中生物样本基体复杂、前处理技术难度大的问题，采用的预处理工艺能够提取出水产品中游离态和结合态的BMAA，采用的高效液相色谱-四级杆串联质谱法联检测方法检测限低、重现性好、灵敏度高、回收率较好和精确度高。

附图说明