[发明专利]一种肺表面活性物质相关蛋白A适配子及其筛选方法

权利要求书

1.一种肺表面活性物质相关蛋白A适配子，其特征在于：其基因序列为：

SEQ ID No:1，或SEQ ID No:2，或SEQ ID No:3。

2.根据权利要求1所述的肺表面活性物质相关蛋白A适配子，其特征在于：其二级结构为：

或，

或，

3.一种如权利要求1或2所述的肺表面活性物质相关蛋白A适配子的筛选方法，其特征在于：步骤如下：

⑴SELEX筛选：SP-A蛋白包被于96孔酶联板上，包被液为pH9.6，0.05mol/L NaHCO₃100uL，于4℃过夜，同时设空白对照孔；SP-A蛋白包被孔和空白对照孔均以质量分数3%的BSA200uL37℃封闭2h；取1000pmol随机ssDNA与100uL结合缓冲液与经3%BSA封闭的空白对照孔37℃结合45min，反筛去除与BSA结合的ssDNA，转移到SP-A蛋白包被孔与SP-A蛋白37℃结合45min；然后用200uL冲洗缓冲液洗去未结合的ssDNA；再加200uL洗脱缓冲液于80℃作用10min，洗脱下与SP-A蛋白结合的ssDNA，取200uL酚：氯仿抽提，乙醇沉淀，将ssDNA溶解于20×TE缓冲液中；

⑵PCR优化：

PCR反应体系为：

PCR反应条件：A.94℃，3min；B.94℃，45s，55℃，30s；72℃，40s；共12个循环；C.72℃，7min；

⑶适配子亲和力及特异性检测：将带有SP-A适配子序列的克隆质粒进行PCR扩增，切胶回收，纯化PCR产物，将5ug SP-A蛋白包被于96孔板上，37℃孵育2h，取10ug纯化物与400uL结合缓冲液混合，加入到蛋白孔中结合30min，然后用洗脱缓冲液洗去未结合ssDNA，再加入50uL洗脱缓冲液，80℃孵育10min，洗脱下与蛋白结合的ssDNA，测定其含量，分析各适配子的亲和力；根据适配子亲和力测定结果，筛选出亲和力高的几个适配子按上述过程将各适配子分别与SP-A及BSA进行结合反应，通过适配子对两种蛋白亲和力的不同判断其特异性；

⑷克隆与测序及适配子结构分析：经9轮筛选得到的ssDNA，经PCR扩增成dsDNA，回收纯化后连PuC18载体，经蓝白斑筛选，挑选亲和力及特异性高的3个克隆进行序列测定，使用DNAMAN软件分析，即得肺表面活性物质相关蛋白A适配子。

4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤⑴中结合缓冲液为SHCMK液：20mmol/L Hepes pH7.35，5mmol/L KCl，120mmol/L NaCl，1mmol/L MgCl₂，1mmol/L CaCl₂。

5.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤⑴中冲洗缓冲液为SHCMK液与质量分数为0.05%的Tween20的混合液，V_SHCMK:V_Tween20为20:1。

6.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤⑴中洗脱缓冲液为：20mmol/L Tris-Hcl，4mol/L异硫氰酸胍，1mmol/L DTT，pH8.3。

7.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤⑴中酚：氯仿的体积比为1:1。

8.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤⑶中克隆质粒的制备方法为：将第9轮筛选SP-A适配子进行扩增，产物纯化后与PuC18载体分别进行双酶切，再将两者的双酶切产物在16℃条件下过夜连接，将连接产物转入大肠杆菌中，即得。