[发明专利]一种肺表面活性物质相关蛋白A适配子及其筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种肺表面活性物质相关蛋白A适配子及其筛选方法。 

背景技术

肺表面活性物质相关蛋白A(Surfactant Protein A，SP-A)是一种多功能糖蛋白，在调节肺表面活性物质(PS)代谢、基因表达、肺内免疫及炎症反应方面具有十分重要作用。SP-A主要在肺泡Ⅱ型上皮细胞中合成，在肺外表达量很少，在肺内则为高浓度表达，表现为肺特异性。其表达水平的高低与临床某些肺部疾病直接相关，是某些肺部疾病的特异性诊断和判断预后的指标。很多肺部疾病在早期依据临床表现、X线征象以及一些创伤性检查，难以做到早期诊断并评价肺泡一毛细血管屏障损伤程度。近年来很多实验表明，血清SP-A是反映肺功能障碍和血气屏障损伤敏感而可靠的指标。当疾病导致肺部损伤后，肺内SP-A可通过损伤的肺泡－毛细血管膜屏障进入血液循环而成为肺损伤的血清标志物。血清中SP-A的量和肺损伤程度密切相关，肺部损伤越重血清中SP-A浓度就越高，检测患者血循环中SP-A水平可以判断肺损伤程度，预测疾病转归情况。但是目前检测SP-A的方法都较为繁琐。 

指数式富集的配体系统进化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术是一种新的组合化学技术，应用大容量的随机寡核苷酸，并结合PCR体外扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经几轮或数轮的筛选过程，获得高亲和力、高特异性的核酸配基。在实验诊断和临床治疗的分子识别领域，它提供了一个比抗体更快速、灵敏的技术手段。目前，该技术已成功应用于许多靶物质的筛选，包括蛋白、小分子、金属离子，甚至病毒、细菌、细胞等一些复杂靶标，部分核酸适配子已进入临床试验阶段。 

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种与SP-A结合率高、特异性强的肺表面活性物质相关蛋白A适配子及其筛选方法。 

本发明实现目的的技术方案是： 

一种肺表面活性物质相关蛋白A适配子，其基因序列为： 

SEQ ID No:1，或SEQ ID No:2，或SEQ ID No:3。 

而且，其二级结构为： 

或， 

或， 

如上所述的肺表面活性物质相关蛋白A适配子的筛选方法，步骤如下： 

⑴SELEX筛选：SP-A蛋白包被于96孔酶联板上，包被液为pH9.6，0.05mol/L NaHCO₃100uL，于4℃过夜，同时设空白对照孔；SP-A蛋白包被孔和空白对照孔均以质量分数3%的BSA200uL37℃封闭2h；取1000pmol随机ssDNA与100uL结合缓冲液与经3%BSA封闭的空白对照孔37℃结合45min，反筛去除与BSA结合的ssDNA，转移到SP-A蛋白包被孔与SP-A蛋白37℃结合45min；然后用200uL冲洗缓冲液洗去未结合的ssDNA；再加200uL洗脱缓冲液于80℃作用10min，洗脱下与SP-A蛋白结合的ssDNA，取200uL酚：氯仿抽提，乙醇沉淀，将ssDNA溶解于20×TE缓冲液中； 

⑵PCR优化： 

PCR反应体系为： 

PCR反应条件：A.94℃，3min；B.94℃，45s，55℃，30s；72℃，40s；共12个循环；C.72℃，7min； 

⑶适配子亲和力及特异性检测：将带有SP-A适配子序列的克隆质粒进行PCR扩增，切胶回收，纯化PCR产物，将5ug SP-A蛋白包被于96孔板上，37℃孵育2h，取10ug纯化物与400uL结合缓冲液混合，加入到蛋白孔中结合30min，然后用洗脱缓冲液洗去未结合ssDNA，再加入50uL洗脱缓冲液，80℃孵育10min，洗脱下与蛋白结合的ssDNA，测定其含量，分析各适配子的亲和力；根据适配子亲和力测定结果，筛选出亲和力高的几个适配子按上述过程将各适配子分别与SP-A及BSA进行结合反应，通过适配子对两种蛋白亲和力的不同判断其特异性；