[发明专利]稳定表达临床拉米夫定耐药性乙型肝炎病毒细胞株的构建方法

权利要求书

1.拉米夫定耐药性乙型肝炎病毒细胞株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)引物的设计与合成：合成如下表所示的引物，P1、P2为扩增HBV全基因上下游引物；A1、A2为扩增A片段的上下游引物，B1、B2为扩增B片段的上下游引物，C1、C2为扩增C片段的上下游引物，D1、D2为扩增D片段的上下游引物；

(2)PCR扩增：以含rtL180M+rtM204V双重变异HBV基因组的T-HBV为模板，应用相应引物，通过PCR技术扩增A、B、C、D基因片段；进一步以A、B、C、D基因片段为模板，应用相应引物，通过重组PCR技术扩增A+B与C+D基因片段；

(3)1.3倍HBV全基因的定向克隆将pcDNA3.1(+)质粒经Hind III和Not I双酶切，将A+B基因片段和C+D基因片段分别用Hind III、EcoR I和EcoR I、Not I双酶切，然后应用三片段连接法将A+B、C+D基因片段定向克隆至pcDNA3.1(+)载体，获得含有1.3倍HBV全基因的真核表达载体pcDNA3.1-1.3HBV；

(4)细胞转染与抗性筛选：采用脂质体转染方式将无内毒素的含rtL180M+rtM204V双重变异株的真核表达质粒pcDNA3.1-1.3HBV转染人肝癌细胞株HepG2细胞；转染后，将转染细胞以1∶10的比例传代至新的培养板；24h后，更换含590-610μg/ml G418的DMEM筛选培养液进行抗性筛选，每3至4天更换一次筛选培养液，直至培养孔中出现单细胞克隆；然后将单细胞克隆转移至培养瓶，加入筛选培养液进一步扩大培养。细胞长满培养瓶后改用半数筛选浓度的G418(290-310μg/ml)作为维持浓度传代培养，细胞株命名为HepG2.RL1，每2-3天传代一次。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的传代经历至少8代，优选至少10代。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的脂质体转染试剂是Invitrogen公司的lipofectamion-2000转染试剂，转染操作按照说明书的记载进行。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法所构建的稳定表达临床拉米夫定耐药性乙型肝炎病毒细胞株。

5.根据权利要求4所述的稳定表达临床拉米夫定耐药性乙型肝炎病毒细胞株，其特征在于所述病毒细胞株基因组中含有SEQ ID NO.1-5任意一个或者多个所代表的DNA序列。