[发明专利]稳定表达临床拉米夫定耐药性乙型肝炎病毒细胞株的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种稳定表达核苷类似物拉米夫定耐药性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的细胞株，该细胞株所含的病毒来源于临床上拉米夫定耐药的慢性乙型肝炎患者血清，病毒的DNA聚合酶/逆转录酶区存在确切核苷类药物拉米夫定耐药变异位点。

背景技术

HBV感染具有高度的种属和组织特异性，只感染人和黑猩猩等灵长类动物的肝脏细胞，体外直接培养比较困难。目前，通过DNA转染技术将HBV基因片段导入宿主细胞，建立能够支持HBV复制与表达的细胞模型是研究HBV致病机理及抗病毒药物体外筛选的主要途径。

HBV基因组结构紧凑，开放读码框架分布于全长DNA，且不同读码框架相互重叠。因此，需要含大于3.2kb HBV基因片段的载体才能在转染细胞内建立HBV的复制状态。1987年，Sells等首次将两个HBV头尾串连二聚体以尾对尾的方式连接后连同抗G418质粒直接导入受体细胞人肝癌细胞株HepG2构建成含4.0倍HBV DNA的转染细胞模型，命名为HepG2.2.15。该细胞能够长期稳定的分泌HBsAg，HBeAg和完整的HBV颗粒，并能产生各种HBV复制中间体，是目前公认的HBV全基因稳定表达细胞株，是应用较为广泛的细胞模型。HepG2.2.15细胞在接种培养板后24h即可检测到HBsAg与HBeAg的分泌，随着接种时间延长，抗原分泌量逐渐增加，于接种后7-8天达高峰，之后呈现平台现象。这种稳定性是瞬时转染细胞株所无法比拟的，从而为HBV生物学特性、致病机制及慢性乙型肝炎的防治等研究奠定基础。此后，国内外众多学者分别以不同生物学技术建立了支持HBV复制与表达的细胞株，并用于HBV致病机理及抗HBV药物体外活性评价研究。

HBV稳定表达细胞株的建立为HBV DNA结构与功能、基因的表达与调控、HBV致病机理以及抗病毒药物的体外筛选研究提供了有力的工具。但随着核苷类抗病毒药物，尤其是拉米夫定的广泛应用，临床上出现越来越多的HBV耐药株。拉米夫定(lamivudine，LAM)作为第一个抗HBV核苷类药物于1998年上市以来，标志着慢性乙型肝炎进入核苷类似物治疗的时代，且一度成为治疗慢性乙型肝炎的首选药物，其问世推动了慢性乙型肝炎治疗的新进程。拉米夫定主要作用于HBV cccDNA以下的复制期，抑制前基因组RNA逆转录为HBV DNA的负链及正链的合成，所以不能清除肝细胞内的cccDNA。停药后肝细胞内的cccDNA又继续进行复制，因而需长期用药治疗抑制HBV DNA的复制。但长期治疗期间，在药物的选择压力下，HBV DNA聚合酶的酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(tyrosine-methionine-asparticacid-asparticacid，YMDD)基序容易发生变异，主要是第204位的蛋氨酸(methionine，M)被缬氨酸(valine，V)或异亮氨酸(isoleucine，I)取代，即发生rtM204V/I变异。此外，与拉米夫定耐药相关的变异还有rtL180M、rtV173L、rtL80/V/1、rtA181T、rtG172E、rtG174C变异，这些变异部分是作为rtM204V/I变异的补偿变异，以弥补rtM204V/I变异所致的复制能力下降或者增强该变异株的耐药性。研究表明，HBV耐药的发生率与拉米夫定用药时间呈正相关，用药1年后耐药发生率为23％，用药5年后则增加到76％。体外研究表明，HBV一旦发生变异，其对拉米夫定的敏感性将下降10000多倍。此外，HBV对拉米夫定产生耐药后，拉米夫定所致的组织学改善也将逆转，长期用药延缓或者阻止肝纤维化或肝硬化的作用也会大大降低。因此，有必要建立能够稳定持续表达拉米夫定耐药性HBV的细胞株，以用于HBV对拉米夫定耐药的机理及新型抗拉米夫定耐药性HBV药物的体外筛选研究。