[发明专利]利用地高辛标记EDC交联桥连法检测miRNAs方法

权利要求书

1.一种利用地高辛标记EDC交联桥连法检测miRNAs方法，包括以下步骤：

1)  样本细胞总RNA的提取

用Trizol提取样本细胞总RNA；

2) miRNA的捕获与连接

首先进行miRNA的捕获，体系为：7μl RNA+ddH₂O，1μl 1pmol/μl Bridge，1μl 10×Capture buffer,1μl 1pmol/μl 3’DIG-probe,混匀，在PCR仪中进行如下程序：94℃，1min；65℃，2min；37℃，10min；

然后向上述反应中加T4 DNA连接酶混合物进行连接，体系为：1μl T4 DNA连接酶，1.5μl 10×T4 buffer，2.5μl  ddH₂O；在30℃下反应1h，该反应产物为最终加样样品； 

3) 含8M尿素的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1) 按照以下比例配制含有8M尿素的15%PAGE胶：3.75ml 40% acrylamidel，1ml 5×TBE，4.2g Urea，45μl 10%APS，10μl TEMED，最后加水补至10ml，混匀后灌胶；

(2) 样品准备：将上一步中的样品等量与RNA loading buffer混匀；

(3) 变性：均匀混合样品，95℃变性3分钟后，立即冰上放置；

(4) 预电泳：正确安装电泳装置，倒入0.5×TBE电泳缓冲液，用注射器吹打电泳孔的残胶，120V，预电泳20分钟；

(5) 点样：预电泳后再次用注射器吹打电泳孔，点样；

(6) 恒压电泳：120V电泳约2.5小时，溴酚兰跑到胶底部；

4) 转膜

按照胶的面积，裁剪同样大小的带正电荷的尼龙膜和WATMAN滤纸，做成三明治状，用半干转移仪转膜，转膜30分钟；

5)   EDC交联：转膜后将膜取出，放在浸有EDC交联试剂的WATMAN滤纸上，60℃作用1-2h；

6) 封闭

把膜放入1% Blocking buffer中，室温封闭0.5小时；

7) 加抗体

   加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体于1% Blocking中（1：15000），室温孵育0.5小时；

8) 洗涤

Washing buffer(Maleic Acid Buffer(pH7.5),0.3% Tween 20(v/v) )洗膜2次，每次15分钟；

Detecting buffer（Detecting buffer：6.055gTris和2.9gNaCl加入480ml水中，用浓盐酸调至PH 9.5，定容到500ml）洗膜1次，每次5分钟；

9)显影

(1) 膜正面放上适量CDP-Star ready-to-use试剂，确保膜上全部铺满，室温孵育5分钟后挤掉试剂，用滤纸吸干残液，放入暗盒中用X光片曝光；

(2) 将X光片从暗盒中取出，放入D76显影液中1-2分钟，放入自来水中停影，然后放入定影液中定影15分钟，最后水洗晾干。