[发明专利]利用地高辛标记EDC交联桥连法检测miRNAs方法

说明书

技术领域

本发明提供一种利用地高辛标记EDC交联桥连法检测miRNAs方法，可以非放射性、快速及高灵敏度检测microRNAs。

背景技术

近几年，生物医学研究中最重要的发现之一就是发现大小为约22nt的非编码microRNAs（miRNAs）。这些小分子RNA不被翻译成蛋白，而是可以通过碱基互补配对作用于mRNA，使靶标mRNA降解或翻译被抑制。据估计，哺乳动物细胞只有大约1%的基因组编码miRNAs分子，而这些miRNAs则调控哺乳动物1/3的编码基因，足见其对细胞生命活动的重要性。

研究miRNA在生物体内的时间和空间表达谱能使研究者更好地理解miRNAs的生物学功能。为了达到这一目的，已有许多技术应用于miRNAs和其他小分子RNAs的检测，包括基于微阵列芯片和微球技术的高通量检测方法、滚环扩增法、引物入侵法、ELISA检测方法、磁珠检测方法、基于荧光标记技术和单分子检测技术的检测方法。这些技术要么需要特殊和昂贵的仪器，要么步骤繁琐。目前检测小分子RNA最简单和应用最广的方法是应用放射性同位素标记系统的Northern blots检测。然而，放射性同位素既不方便又不安全，且许多地方没有使用同位素的条件，因此应用放射性同位素的Northern blots检测方法受到很大限制。相反，与同位素标记系统相比，地高辛（DIG）标记系统有许多优势：曝光时间短，储存时间长，经济，尤其是安全性高。然而， DIG标记系统的灵敏度远不及放射性同位素标记系统，即使增加RNA量，有时也无法检测到表达量低的microRNAs。尽管Kajigaya及其同事应用3’-DIG标记的RNA探针能把检测miRNA的灵敏度提高到和同位素一样，但是对一些低丰度表达的miRNAs仍然无法检测到，而且RNA探针既昂贵又不易稳定储存。Bino John等人发明了一种LED方法检测miRNAs，该方法结合了LNA修饰探针，EDC交联和DIG标记系统，使得该方法既安全又有非常高的灵敏度，但是由于LNA修饰探针从设计到合成都非常昂贵，因此这些方法都未得到广泛应用。

鉴于传统的Northern blots检测方法试验周期长，步骤繁琐，近年来有学者应用一种桥连技术检测微小RNA，。该技术需要设计一个检测miRNA的特异寡核苷酸片段（桥接片段），该片段3’端与检测的miRNA反向互补，5’端为一与5’端³²P标记的随机片段反向互补的序列。复性时，该桥接片段能与miRNA和³²P标记的探针杂交，从而把两者拉在一起，中间只有一个缺口，该缺口能通过T4 DNA 连接酶修复，从而使miRNA标记上了³²P。桥连法比传统的Northern blots更加方便，同时灵敏度也比传统的Northern blots法高至少50倍左右，检测RNA浓度范围也比传统方法高40倍。

通过一些方法把RNA交联到膜上能提高Northern blots方法的灵敏度。然而，一些传统的方法比如，紫外交联法却不能很好地交联微小RNA。

发明内容

本发明的目的是公开一种利用地高辛标记EDC交联桥连法检测miRNAs方法，解决了当前检测方法安全性不高、程序复杂、价格昂贵、灵敏度低等问题。

本发明提供的利用地高辛标记EDC交联桥连法检测miRNAs方法（以下简称：DSLE法），包括以下步骤：

1)  样本细胞总RNA的提取

用Trizol提取样本细胞总RNA。

2) miRNA的捕获与连接

首先进行miRNA的捕获，体系为：7μl RNA+ddH₂O，1μl 1pmol/μl Bridge，1μl 10×Capture buffer,1μl 1pmol/μl 3’DIG-probe,混匀，在PCR仪中进行如下程序：94℃，1min；65℃，2min；37℃，10min。然后向上述反应中加T4 DNA连接酶混合物进行连接，体系为：1μl T4 DNA连接酶，1.5μl 10×T4 buffer，2.5μl  ddH₂O ；在30℃下反应1h，该反应产物为最终加样样品； 

3) 含8M尿素的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1) 按照以下比例配制含有8M尿素的15%PAGE胶：3.75ml 40% acrylamidel，1ml 5×TBE，4.2g Urea，45μl 10%APS，10μl TEMED，最后加水补至10ml，混匀后灌胶；