[发明专利]一种利用天津短杆菌和植物乳杆菌混合发酵高产GABA的方法

说明书

技术领域

一种利用安全高效的天津短杆菌和植物乳杆菌混合发酵高产GABA的方法，属于发酵工程和酶工程领域。

技术背景

γ-氨基丁酸(GABA)是天然存在于某些生物体的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统重要的抑制性神经递质，在食品、饲料、医药等领域具有广泛的应用。γ-氨基丁酸具有抗焦虑、降血压、镇定安神、增强记忆、调节激素分泌、促进生殖、利尿，镇痛等生理功能。

γ-氨基丁酸的制备主要通过化学合成法和生物法。其中生物法又包括植物富集法和微生物发酵法。化学法主要是通过邻苯二甲酞亚氨钾和γ-氯丁氰在强烈条件下(180℃)反应，然后产物与浓硫酸水解得到；另一种方法是以吡咯烷酮作为原料，经氢氧化钙、碳酸氢铵水解制得γ-氨基丁酸。总体而言，化学合成法虽然具有反应迅速的优点，但是反应条件苛刻、能耗大、成本高、得率低，反应条件剧烈，污染严重，存在着一定的安全隐患。植物富集主要是利用内源性谷氨酸脱羧酶(EC4.1.1.15)催化谷氨酸制备γ-氨基丁酸。这是植物组织对外界条件的应激反应。这些外界应激条件包括温度、压力、研磨、破碎、酸碱性以及钙离子浓度和氧浓度等。植物富集γ-氨基丁酸虽然制备工艺简单，环境副作用小，但是植物富集γ-氨基丁酸含量较低，不适于规模化生产γ-氨基丁酸。

目前，γ-氨基丁酸的生产主要是微生物发酵法，通过微生物中的谷氨酸脱羧酶催化L-谷氨酸的α-羧基脱羧来生产γ-氨基丁酸。谷氨酸脱羧酶是作用于这一过程的唯一酶，已经在细菌、古生菌和真菌微生物中发现了谷氨酸脱羧酶的存在。微生物发酵法是以谷氨酸或其钠盐或含谷氨酸的物质为原料，利用酵母菌、乳酸菌和曲霉菌等食品安全级微生物发酵制得，具有良好的开发前景。利用微生物将谷氨酸脱羧转化成γ-氨基丁酸具有高度专一性，且发酵法反应条件温和、反应速率快、设备简单、公害少、安全、成本较低等优点。利用微生物转化合成γ-氨基丁酸的研究并将其产业化具有现实需求性。

传统的微生物发酵需要添加外源的谷氨酸或谷氨酸钠盐作为底物，而谷氨酸也是需要以糖质为原料经微生物发酵，采用等电点提取加上离子交换树脂分离的方法而制得。所以添加外源谷氨酸为底物在一定程度上增加了γ-氨基丁酸的制备成本。天津短杆菌SW07-1是一株谷氨酸生产菌的变异株，保存于江南大学生物工程学院(《生物加工过程》，2009年第7卷第6期74-78页)。该菌株缺少γ-氨基丁酸合成途径，但能高效转化葡萄糖为谷氨酸。另外，本研究室前期经诱变筛选获得一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GB01-21(中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号：CCTCCM209102)，此菌株缺少谷氨酸合成途径，但具有较高的谷氨酸脱羧酶活力，能高效催化γ-氨基丁酸的合成。在此基础上，本发明建立了一个有效的转化体系，前期利用天津短杆菌SW07-1进行谷氨酸发酵，再利用植物乳杆菌GB01-21将发酵液中的谷氨酸转化为γ-氨基丁酸，减少底物谷氨酸的添加量，节约了γ-氨基丁酸的制备成本。

发明内容

本发明的目的是利用相对廉价的葡萄糖为原料，通过两步发酵连续发酵生产γ-氨基丁酸，即第一步采用谷氨酸生产菌株将葡萄糖转化为谷氨酸，第二步采用全细胞转化的方法，将能产生谷氨酸脱羧酶的菌株添加到谷氨酸发酵液，建立稳定的转化体系，催化谷氨酸脱羧形成γ-氨基丁酸，为微生物发酵法生产γ-氨基丁酸提供了一个新思路以及一个切实可行的新工艺，从而可以降低γ-氨基丁酸的生产成本。

本发明的技术方案：本发明提供了一种利用天津短杆菌SW07-1和植物乳杆菌GB01-21混合发酵高产γ-氨基丁酸的方法。首先利用天津短杆菌SW07-1将葡萄糖转化为谷氨酸，再通过植物乳杆菌GB01-21将上步发酵液中的谷氨酸转化为γ-氨基丁酸。具体过程为先将第一步谷氨酸发酵所得发酵液的pH调到谷氨酸脱羧酶的最适pH，添加缓冲成分，构成稳定的转化体系；再将第二步发酵液经过滤或者离心的方法得到谷氨酸脱羧酶生产菌株植物乳杆菌GB01-21的菌体，将其添加到谷氨酸发酵液转化体系中进行全细胞转化。

实现本发明方法的步骤如下：