[发明专利]一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法

权利要求书

1.一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

根据狐狸肉、老鼠肉、猪肉、鸡肉、鸭肉作为特征靶基因分别设计5对特异性引物：F1/R1、F2/R1、F3/R1、F4/R2、F4/R2 ，即6条特异性引物：F1、F2、F3、F4、R1、R2；

步骤(1).样品前处理：

将肉类及其制品取样，加入10倍肉类及其制品体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质1min，制成组织匀浆样品；

步骤(2).样品DNA提取：

将50 mg组织匀浆样品、200 μl pH值为8.0的 TE缓冲液涡旋混匀，加入400 μl裂解液，混匀，然后加入600 μl的第一混合溶剂剧烈振荡，12000g离心10 min，取上清液加入与该上清液等体积的第二混合溶剂，剧烈振荡，12000 g离心10min，取上清液加入与该上清液等体积氯仿，剧烈振荡，12000g离心10 min，取上清液加入与0.8倍该上清液体积的异丙醇，12000g离心l0 min，得到沉淀物，用70﹪乙醇清洗沉淀物1次，在常温或50℃下，20min晾干，然后加入80 μl pH值为8.0的 TE缓冲液，使沉淀物溶解于TE缓冲液，得到DNA提取物；该DNA提取物即为模板DNA；将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；

所述的TE缓冲液为1 ml 浓度为1 M 、pH值为 8.0的Tris-Cl，0.2 ml浓度为 0.5 M、pH值为 8.0的EDTA，定容至100 ml溶液；         

所述的裂解液为Tris-HCl、乙二胺四乙酸EDTA、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠SDS组成的混合液，其中Tris-HCl的浓度为50 mM、 pH值为 8.0，乙二胺四乙酸EDTA的浓度为25 mM，NaCl的浓度为100 mM，蛋白酶K的浓度为20 μg/μL，十二烷基硫酸钠SDS的质量分数为10﹪；

所述的第一混合溶剂为酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25：24：1；

所述的第二混合溶剂为氯仿、异戊醇的混合液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24：1；

步骤(3).多重PCR扩增：

将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增,得到扩增产物；

所述的PCR扩增反应体系为50 μl由5.0 μl的10×PCR Buffer、0.5 μl浓度为2.5 U/μl 的Taq DNA 聚合酶、4.0 μl浓度为2.5 mmol/L的 dNTPs、6.5 μl加人混合引物、2.0 μl模板DNA和余量的灭菌蒸馏水组成；

所述的多重PCR扩增反应的条件是94℃预变性5min；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸30s，35个循环；72℃延伸7min；

所述的加人混合引物为5对特异性引物的混合引物，其中5对特异性引物的浓度比为F1:F2:F3:F4:R1:R2=1:1:1:2:3:2；

步骤(4).扩增产物电泳检测：

PCR扩增反应结束后，将5μl 扩增产物与1μl 6×Loading Buffer混合，用2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。

2.如权利要求1所述的一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法，其特征在于所述的6条特异性引物具体是：

F1: 5’-CTAGGGGTTTAGGTTAAACG-3’； 

F2: 5’-CACCAAACAAAAACTAAACC-3’；

F3: 5’-GACAGCAGTATTACCATATAAC-3’； 

F4: 5’-GAATCACCTTGACACTGATGCAC-3’； 

R1: 5’- AGGGTATTTAGCTGTTAAC-3’；

R2: 5’-GCGGATACTTGCATGTATATGTC-3’。

3.如权利要求1所述的一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法，其特征在于狐狸特异性引物F1/R1的长度为205 bp，老鼠特异性引物F2/R1的长度为283 bp，猪特异性引物F3/R1的长度为671 bp，鸡特异性引物F4/R2的长度为563 bp，鸭特异性引物F4/R2的长度为405 bp。